همه چیز در مورد تست الایزا elisa

[Artmis.a]

مخفف عبارت Enzyme-Linked Immunosorbent Assay يك روش آزمايشگاهي بيوشيميايي ساده با حساسيت بسيار بالا است كه امكان آناليز تعداد زيادي نمونه را به صورت همزمان فراهم مي كند. اين روش در ايمونولوژي (ايمني شناسي) براي تشخيص وجود يك آنتي بادي يا آنتي ژن در نمونه مورد آزمايش استفاده مي شود كه عموما به عنوان ابزاري تشخيصي در پزشكي و پاتولوژي و همچنين تست كنترل كيفيت در بسياري از صنايع كاربرد دارد.

ELISA بر پايه اندازه گيري كمپلكس رنگي آنتي ژن و آنتي بادي استوار است. به اين ترتيب كه نمونه مورد آزمايش با مقدار نامشخصي آنتي ژن روي فاز جامد (معمولا پليت پلي استيرن) ريخته مي شود، سپس آنتي بادي بازيابي اضافه مي شود تا با آنتي ژن واكنش داده و تركيبي ايجاد كند. آنتي بادي بازيابي با آنزيم پيوندي كووالانسي برقرار مي كند. بين هر مرحله پليت با محلول پاك كننده ملايمي شسته مي شود تا هر پروتئين يا آنتي بادي باقيمانده شسته شود. پيش از آخرين مرحله شستشو، پليت با اضافه كردن زير لايه آنزيمي كشت داده مي شود و ماده رنگي توليد مي شود. طول موج رنگ به دست آمده توسط يك دستگاه اسپكتروفتومتر قرائت شده و ثبت مي شود كه اين طول موج معرف حضور يك آنتي بادي يا آنتي ژن و نيز غلظت آن است. در ELISA هاي قديمي تر زيرلايه رنگ زا به كار گرفته مي شد در حاليكه در تست هاي جديدتر زيرلايه هاي فلوروژنيك با حساسيت بسيار بالاتر مورد استفاده قرار مي گيرد.

امروزه ELISA يكي از قدرتمند ترين روش هاي آزمايشگاهي براي پي بردن به اختلالات سيستم ايمني است، اين تست به منظور پي بردن به آنتي ژن ناشي از ارگاني عفوني در بدن يا مواد غير نرمالي كه معرف برخي بيماري ها است انجام مي شود. همچنين آنتي بادي هايي كه در پاسخ به برخي عفونت ها يا بيماري ها به وجود آمده نيز توسط اين تست قابل تشخيص هستند. تست ELISA اولين آزمايش متداول در غربال زني HIV است. در تست ELISA سرم فرد 400 بار رقيق شده و به صفحه اي كه حاوي آنتي ژن HIV است اضافه مي شود. اگر آنتي بادي HIV در سرم وجود داشته باشد، به اين آنتي ژن هاي HIV مي چسبد. سپس به منظور از بين بردن ديگر اجزا سرم، پليت شستشو داده مي شود. يك "آنتي بادي ثانويه" ساخته شده مخصوص (يك آنتي بادي چسبيده به آنتي بادي ديگري) به پليت اعمال شده و شستشوي ديگري انجام مي شود. اين آنتي بادي ثانويه به صورت شيميايي به آنزيم از پيش تهيه شده مي چسبد. اين بار زير لايه اي براي آنزيم اعمال شده و توسط آنزيم كاتاليز مي شود كه منجر به تغيير رنگ در فلورسانس مي شود.

نتايج ELISA به صورت عددي گزارش مي شود. بحث انگيزترين وجه اين تست تعيين نقطه برش بين نتايج مثبت و منفي است.
علاوه بر آزمايش HIV از ELISA براي آزمايش بيماري هايي چون هپاتيت، تب استخوان شكن، leptospirosis ، عفونت انگلي، تبخال، سرخجه و ديگر عفونت هاي ويروسي و باكتريايي استفاده مي شود.

پيش از پيدايش روش ELISA ، تنها گزينه براي انجام سنجش ايمني، ايمني سنجي راديويي بود، كه از آنتي ژن ها و آنتي بادي هايي كه به صورت راديواكتيو مميز شده بودند استفاده مي شد. در اين روش در صورت وجود آنتي بادي يا آنتي ژني خاص، راديواكتيويته سيگنالي توليد مي كرد. تئوري روش ايمني سنجي راديويي اولين بار سال 1960 توسط Rosalyn Sussman Yalow و Solomon Berson مطرح شد. از آنجايي كه راديواكتيويته خطرات زيستي داشت، پيشنهاد امن تر و ايمن تري مبني بر جايگزيني سيگنال هاي غير راديو اكتيو به جاي سيگنال هاي راديو اكتيو ارائه شد. وقتي يك آنزيم مشخص (مانند پر اكسيداز) با زير لايه مناسب واكنش مي دهد، منجر به تغيير رنگ آن مي شود كه مي تواند به عنوان سيگنال استفاده شود. البته بايد تناسب بين سيگنال و وجود آنتي بادي يا آنتي ژن تعيين مي شد كه اين پروسه توسط Stratis Avrameas و G.B. Pierce انجام شد.

در سال 1966 توسط Wide و Porath اين روش تكميل تر شد. و در سال 1971 Peter Perlmann و Eva Engvall نهايتا به روش ELISA به شيوه امروزي دست پيدا كردند. ELISA امروزي مزاياي زيادي نسبت به روش هاي ايمني سنجي راديويي دارند. از جمله عدم وجود خطر تشعشع، امكان اتوماسيون، امكان افزايش حساسيت روش، عمر طولاني كيت هاي آنزيمي، سرعت خوانش بالا و قيمت ارزان تر دستگاه ها و معرف ها.

تست ELISA با روش هاي گوناگوني انجام مي شود كه كه به صورت كلي به دو دسته ELISA مستقيم و غير مستقيم تقسيم بندي مي شود. در روش مستقيم آنتي ژن يا آنتي بادي مورد نظر به طور مستقيم بر سطح فاز جامد پوشش داده مي شود و سپس آنتي بادي يا آنتي ژن مكمل نشاندار شده آن به سيستم اضافه مي شود. با آناليز سيگنال توليد شده مي توان پي به وجود آنتي ژن يا آنتي بادي مورد نظر در نمونه برد. اين روش ارزش تشخيصي چنداني نداشته و بيشتر كاربرد تحقيقاتي دارد.

در روش غير مستقيم سرم رقيق شده به آنتي ژن هاي پوشش داده شده در فاز جامد اضافه مي شود، سپس نمونه را به آن اضافه كرده و پس از گذشت زمان انكوباسيون و يك مرحله شستشو، آنتي هيومن گلوبولين نشاندار شده با آنزيم به چاهك اضافه مي شود. اين روش براي تعيين آنتي بادي اختصاصي يا تيتراسيون آنتي بادي در سرم استفاده مي شود.

روش هاي ELISA ساندويچ و ELISA رقابتي يا مهاري از ديگر انواع متداول اين تكنيك هستند. روش ساندويچ كه متداول ترين روش ELISA است، يك آنتي ژن در بين دو آنتي بادي اختصاصي قرار مي گيرد. روش هاي رقابتي نيز بر پايه رقابت دو آنتي ژن يا دو آنتي بادي براي اتصال ليگاند با مقدار محدود استوار است. اگر اضافه كردن هردو آناليت به سيستم همزمان انجام شود، روش را رقابتي مي نامند ولي چنانچه ابتدا آناليت اضافه شده و پس از يك دوره زماني انكوباسيون آناليت نشاندار اضافه گردد روش را مهاري مي نامند.

مراحل انجام يك آزمون ELISA كه تقريبا در تمام انواع آن مشترك است عبارت است از:
1) پوشش دهي، كه به معني جذب يك آنتي ژن يا آنتي بادي با سطوح جامد است.
2) اضافه كردن نمونه هاي مورد آزمايش.
3) گذشت مدت زمان كافي براي انجام واكنش كه به اصطلاح انكوباسيون واكنشگرها ناميده مي شود.
4) انجام عمل شستشو توسط واشر ELISA ، به منظورجدا كردن واكنشگرهاي متصل شده و واكنش داده از واكنشگرهاي آزاد و متصل نشده .
5) اضافه عوامل لينك شده با آنزيم.
6) مجددا طي مدت زمان انكوباسيون براي واكنشگرها .
7)استفاده مجدد از واشر ELISA جهت انجام عمل شستشو .
8) افزودن زيرلايه آنزيم جهت تشخيص واكنش دهنده ها.
9) طي زمان انكوباسيون.
10) اتمام واكنش آنزيمي توسط متوقف كننده ها و خوانش دانسيته نوري به دست آمده توسط خواننده .ELISA

براي انجام تست ELISA بايد نمونه خون از بيمار گرفته شود و سرم آن جدا شود. براي اين كار بايد به مواردي دقت داشت. مثلا از بستن گارو براي مدتي طولاني بايد اجتناب كرد چرا كه ممكن است در پارامترهاي مورد اندازه گيري تاثير گذاشته و موجب بروز خطا شود. در هنگام جداسازي سرم نيز بايد دقت شود كه فيبرينوژن يا ذرات ديگر نباشد.

پيش از انجام آزمايش بايد به كيفيت كيت هاي مورد مصرف توجه كرد، همچنين نگهداري آن ها بايد در دماي C 8-2 صورت گيرد. تمامي محلول هاي موجود در كيت قبل از مصرف بايدخوب مخلوط شده و به دماي آزمايشگاه برسد و پس از استفاده به منظور افزايش پايداري، بلافاصله اجزاء كيت به يخچال منتقل شود. درحين انجام آزمايش بايد از نوسانات غير تدريجي دما در هنگام انكوباسيون، مانند باز بودن پنجره يا درب آزمايشگاه در محل آزمايش جلوگيري كرد. ايجاد پديده هوك باعث ايجاد نتايج پايين كاذب مي شود لذا توصيه مي شود براي جلوگيري از اين پديده سرم رقيق نشده و سرم يك دهم رقيق شده، مخلوط وآزمايش را انجام دهيم، تا اثر احتمالي هوك اصلاح شود.

از آنجا كه فريز و ديفريز كردن نمونه ها باعث كاهش سطح برخي از هورمون ها مي شود، بايد تا حد ممكن از اين كار پرهيز شود. پيش از اندازه گيري بايد كليه ابزارهاي مورد استفاده اعم از نوك ابزار نمونه گيري و كيت ها استريل شوند. كه البته استفاده از ابزارهاي يكبار مصرف پيشنهاد مي شود و بايد قبل از استفاده لوله آزمايش هاي شيشه اي آن ها را با اسيد سولفوريك رقيق شستشو داده و با آب مقطري كه دوبار تقطير شده آبكشي انجام داد. از به كار بردن محلول هاي شستشوي نامناسب يا آب مقطر ناخالص بايد پرهيز كرد. ضمنا بايد از كاركرد صحيح دستگاه ها و تجهيزات مورد استفاده به عنوان مثال از صحت طول موج فيلترهاي خواننده ELISA به كمك استفاده از ماده رنگي با ثبات، نظير بيكرومات پتاسيم يا عملكردصحيح دستگاه واشر ELISA اطمينان حاصل كرد.

 

[Artmis.a]

شيكر ELISA SHAKER) ELISA)
تكان دادن ميكروپليت ها )shaking( از مهم ترين بخش هاي تكنيك ELISA است، چرا كه تاثير زيادي در تغيير رنگ محيط آنزيمي پس از افزودن محلول اسيدي دارد. استفاده از روتاتور معمولي با قطر چرخش زياد و تعداد دور كم و در نتيجه تكان دادن آهسته ميكروپليت ها باعث خوب مخلوط نشدن معرف ها و در نتيجه ادامه و پيشرفت جزئي واكنش در طي زمان و به روز خطا مي شود.

همچنين تكان شديد اين پليت ها نيز باعث آلوده شدن چاهك هاي ميكرو پليت با هم مي شود. شيكر ELISA دستگاهي است كه براي مخلوط كردن محتويات ميكروپليت ها به كار گرفته مي شود. شيكر ELISA با حركت سريع با قطر چرخش كم باعث اختلاط مناسب معرف ها و در نتيجه پيشرفت واكنش در طي زمان مي شود. شيكرهاي امروزي مجهز به سيستم كنترل زمان و كنترل دور به صورت ديجيتال است.

واشر ELISA washer)ELISA)
از ديگر مراحل مهم تست ELISA ، شستشو است كه در هر مرحله از تست به منظور دفع و تخليه كامل مولكول هاي غير اختصاصي از محيط واكنش انجام مي گيرد. شستشو به دو صورت دستي و خودكار انجام مي شود. ابتدايي ترين روش شستشو، شستشوي دستي است بدين ترتيب كه مايع شستشو را با پيپت بر روي چاهك ها ريخته و سپس آن را در سينك خالي مي كنند.

فشار بالاي شستشو در روش دستي كه به علت تخليه سريع بافر به وجود ميآيد، منجر به جداشدن و حذف اتصالات اختصاصي از كف چاهك ها و كاهش كاذب مي شود، همچنين فشار پائين شست شو ناشي از تخليه آهسته بافر، باعث عدم دفع كامل اتصالات غير اختصاصي و افزايش كاذب جذب نوري مي شود. بهتر است در روش دستي تا نزديك لبه فوقاني چاهك ها از محلول شستشو پر شود، در صورت پر شدن لب به لب چاهك ها، احتمال آلودگي چاهك به چاهك افزايش پيدا مي كند.

همچنين بايد از سرريز شدن محلول شستشو، ايجاد حباب هوا در چاهك ها و تماس با كف چاهك جلوگيري كرد. در هنگام تخليه چاهك ها نيز بايد مكش و تخليه به طور كامل انجام شده و دقت شود كه حتي ذره اي از مايع بافر در كف چاهك ها باقي نماند. اما اين روش شستشو (شستشوي دستي) بسيار وقت گير بوده و خطر آلودگي محيط و كاربر را در پي دارد. از اين رو دستگاه هاي خودكار واشر ELISA براي شستشوي پليت ها به وجود آمده است كه علاوه بر دقت و ايمني بالاتر، سريع تر و راحت تر عمل شستشو را انجام مي دهند.

اين دستگاه ها در انواع مختلف 8 يا 12 كاناله، تك سوزنه و دوسوزنه موجود است. در انواع دو سوزنه، يك سوزن براي ريختن و ديگري براي خالي كردن محلول شستشو استفاده مي شود بدين ترتيب كه يك سوزن به طور دائم در حال مكش است تا اگر مايع شوينده بيشتري در هنگام پر كردن وارد چاهك ها شد ، آن را خالي كند و اين در حالي است كه در مدل تك سوزنه تمامي اقدامات توسط همان يك سوزن صورت مي گيرد.

خواننده ELISA reader) ELISA)
خواننده ELISA در واقع يك دستگاه فتومتر است كه در آخرين بخش از تست ELISA به طور اختصاصي براي خواندن نمونه هاي مربوطه طراحي شده است. وظيفه آن طيف سنجي نوري يا خوانش دانسيته نوري واكنش ELISA است.

طول موج مشخصي از نور از پائين درون چاهك مي گذرد، در مسير آن فيلتر مناسبي باتوجه به نوع آنزيم و نوع سوبستراي آنزيم جهت دستيابي به طول موج مطلوب قرار داده مي شود. در بسياري از خوانشگرها سيستم تك موج يا دو موج است و جهت برطرف سازي نقص سيستم نوري ، تغييرات چاهك به چاهك حجم نهايي در چاهك ها، تصحيح جذب نوري به طور خودكار صورت مي گيرد .

اين عمل توسط نوع خاصي از فيلترتحت عنوان فيلترهاي تفاضلي صورت مي گيرد. خوانش ميزان جذب محتوي چاهك ها توسط خواننده ELISA الزاما بايستي در زمان تعيين شده انجام شود. بعضي از دستگاه هاي خواننده ELISA قابليت برنامه ريزي زماني، نوع تشخيص و كنترل و در نهايت مشخص كردن مثبت يا منفي بودن نمونه هاي مجهول را دارا هستند.

امروزه انواع مختلفي از خوانشگرها براي پليت ها ي ELISA در بازار موجود هستند اكثر اين خوانشگرها يك ستوني يا 96 خانه (يك پليتي) بوده كه اكثرا خودكار و تعداد اندكي نيز دستي هستند. اين دستگاه ها داراي فيبرهاي نوري هستند. در دستگاه هاي خواننده انتخاب طول موج توسط فيلترها يا گريدها (گريتينك ساختارهايي كه با تابيده شدن نور به آن ها، تنها نور با طول موج خاصي ازآن ها ساطع مي شود) انجام مي شود. براي چاپ نتايج نمونه هاي موردآزمايش ، يا دستگاه خود داراي پرينتر است يا مي توان آن را به پرينتري متصل كرد. همچنين مي توان جهت انجام محاسبات بيشتر خواننده ELISA را به كامپيوتر وصل كرد

 

[Artmis.a]

آنتی ژن ترکیب پلی ساکاریدیا پروتینی است که میتواند باعث تولید آنتی بادی های خاص گردد و می تواند به طور اختصاصی بر روئ محل های خاصی از آنتی بادی متصل شود به نام پاراتون Antigen banding site هر آنتی بادی دو یا چندین پاراتوپ دارد . آنتی بادی مولکولهای ایونوگلوبین هستند که توسط لنفوسید های B یک حیوان در پاسخ به یک محرک آنتی ژن تولید شده و قادرند به یک آنتی ژن متصل شوند . اپیتوپ antigentic leterminent a. site محلی از مولکول آنتی ژن است که قادربه تحریک تولید آنتی بادی بوده و به طور اختصاصی به آنتی بادی متصل میشود . هر آنتی ژن یک یا چند اپی توپ دارد هر پاراتوپ یک اپی توپ را تشخیص میدهد مولکولهای آنتی بادی پنج کلاس دارند

IgG.IgA.IgM.IgD.IgE

Ig =imunuogolobolin

تست های سرولوژیکی در تشخیص نهایی یک ویروس ناشناخته و مطالعه روابط بین نژادها واسترین های یک ویروس مهم است. اساس این تست ها اتصال هر آنتی بادی با آنتی ژن خاص آن است که یکی از این تستها ELISA است Enzyme link eimuno sorbent assay در این روش آنزیم به آنتی بادی متصل شده و با استفاده از سوبسترای مخصوص آنزیم این آنزیم ردیابی می شود تغییر رنگ ایجاد شده بیانگروجود آنزیم است





رایجترین روش الایزا :



ساندویچ دو طرفه الایزا

DAS-ELISA

(Double Antibody sandwic ELISA)

در این روش آنتی ژن در بین دو لایه آنتی بادی قرار می گیرد که آنتی بادی ثانویه متصل به آنزیم است

آنزیمی که بیشتر استفاده می شود آنزیم آلکالید فسفاتاز است سوبسترای مخصوص این آنزیم D.nitropheny phosphate است که این سوبسترا توسط آلکالید فسفاتاز هیدرو لیز شده و پارانیترو فنول تشکیل می شود که زرد رنگ است برای اینکه آنزیم بهتر اثر داشته باشد محیط عمل آنزیم باید قلیایی باشد



بافر های مورد استفاده در روش داس الایزا :



بافر پوششی coating buffer

Na2Co3_____1.59gr

NaHco3_____2.9 gr

NaN3_____0.2gr

این مواد ابتدا در حدود 900 سی سی آب مقطر حل کرده سپس PH را باHCL به 9.6 تنظیم سپس با آب مقطر به یک لیتر میرسد که در یخچال قابل ذخیره است ولی قبل از مصرف باید PH آن چک شود.



فسفات بافر سالین Phosohate buffer salin (pbs)

Nacl_____8gr

KHcpo4_____0.2gr

Kcl_____0.2gr

Nan3_____0.2gr

grا NaHPO4,2H2O_____1.44gr Na2HPO4_____1.15gr NaHPO4,12H2O_____2.9

این مواددر 900 سی سی آب مقطر حل سپس PHرا باNaoH یاHCL به 7.4 تنظیم و سپس حجم آن را با آب مقطر به 1 لیتر می رسانیم.



بافر شستشو Washing buffer(PBS_T)

PH=7.2 -7.4

PBS=1 lit

Twee20=0.5 cc



بافر استخراجی(بافر نمونه یا بافر عصارگیری )

Extra ction b.

(PBS_TPO)

PBS_T=1lit

PVP=20gr

OVAL BAMIN=2gr



بافر استخراجی

هیدروکسی متیل آمینو متان(تریس)=2.3 gr

NaCL=8gr

PVP=2gr

T_20=0.5 cc

KCL=0.2gr

NAN3=0.2gr

PH=7.4 حجم محلول را با آب مقطر به یک لیتر می رسانیم.





بافر استخراجی مخصوص غده پیاز و بذر کاهو

بافر استخراجی بالا=100cc

آلبومین تخم مرغ =10 gr



بافر استخراجی برای انگور

تریس =2.3gr

تریسHCL=37.2gr

NaCL=8gr

PEG(600MW)=10 GR

PVP=20gr

T_20=0.5cc

NaN3=0.2gr

در یک لیتر آب مقطر حل میکنیم وPHآن را به 8.2میرسانیم.



بافر کانژوگهCanjugate buffer Ab-E

که اتصال آنتی بادی آنزیم میباشد معمولااز بافر استخراجی شماره 1 برای تهیه کانژوگه استفاده می شود

NaCL=8gr

T_20=0.5cc

NgCL6H2O=0.2gr

NaN3=0.2gr

تریس =2.4gr

KCL=0.2gr

PVP=20gr

BSA=2gr(bovine serum albumine

که PHآن را به 7.4میرسانیم و حجم آن را با آب مقطر به 1000 سی سی ميرسانیم



بافر سوبسترا Substrate buffer

دی اتانول آمین =97cc

آب مقطر=800cc

NaN3=0.2gr

PHرا با HCLبه 9.8تنظیم می کنیم سپس حجم آن را با آب مقطر به یک لیتر می رسانیم.

پلیت دارای 96 چاهک است که جنس آن از پلی استرن یا پلی ونیل است که در نوع پلی استرن واکنش های غیر اختصاصی کمتری اتفاق می افتد . در بعضی موارد کف چاهک تخت است و بعضی به صورت زاویه ای است هر کیت پلیت مخصوصی دارد .

 

[Artmis.a]

مراحل تست DAS ELISA

· مرحله اول : ابتدا آنتی بادی در بافر پوششی بر اساس نسبتی که مشخص شده رقیق شدهسپس در هر چاهک 100Mlitیا200 Mlit ریخته میشود بعد از ریختن آنتی بادی در چاهک ها پلیت ها به مدت معمولا 4ساعت در 37درجه یا در بعضی مواقع بین 2-4 ساعت در یک انکوباتور مرطوب نگه داری می شود بعد از ریختن آنتی بادی روی پلیت با پارافیلم پوشش داده میشود بعد از اتمام انکوباتور محتویات چاهک ها خالی شده و چاهک ها با بافر شستشو شسته می شوند .

· مرحله دوم: هر چاهک حداقل 3 بار به مدت 3دقیقه شسته می شود .آنتی بادی ها به دیواره شیشه چسبیده می شود در شستشو اضافی ها حذف می شود که بهcoatingمعروف است.

· مرحله سوم در هر چاهک 100-200Mlitعصاره لوله ریخته میشود و شپش پلیت را با پارافیلم پوشش داده و یک شب در دمای 4درجه یخچال نگه داری میشود .نمونه های گیاهی به نسبت 1;3 W/Gدر بافر استخراجی با استفاده از هاون یا داخل پلاستیک ضخیم له شده وعصاره گیری می شود در زمان ریختن عصاره ها در چاهک برای هر نمونه از یک نوع سمپله استفاده میشود. معمولا از هر نمونه گیاهی 2تکرار گذاشته میشود در برخی از چاهک ها از نمونه های کنترل مثبت و منفی استفاده میشود . میتوانید بعد از اولین شستشو پلیت ها را در دمای -20 درجه برای چند هفته نگه داری کنیم

· مرحله چهارم: بعد از اتمام انکوباتور شستشو مطابق قبل که باید دقت شود عصاره چاهک ها با هم تلفیق نشوند

· مرحله پنجم :کانژوگه (اتصال آنزیم آنتی بادی در بافر مخصوص )قسمت مشخص شده رقیق می شود سپس در هر چاهک 100-200Mlit ریخته میشود ودر دمای 37 درجه به مدت4ساعت یا 3-6ساعت در دمای 37درجه نگه داری می شود انکوباتور باید مرطوب باشد

· مرحله ششم : شستشو مطابق مرحله دوم انجام می شود چون اگر درست انجام نشود آنزیم های آزاد واکنش خواهند داد.

· مرحله هفتم : سوبسترا به غلظت 1 میلی گرم در لیتر در بافر سوبسترا حل شده و در هر چاهک 100-200Mlit ریخته می شود بافر باید تازه تهیه شده باشد . بعد از ریختن سوبسترا پلیت در دمای اطاق و تاریکی به مدت 120-30 دقیقه نگه داری میشود باید مطمئن باشیم که تمام وسایل مورد استفاده فاقد آلکالید فسفات باشد سطوح دست و پوست دارای آلکالید فسفاتاز انسانی است .سوبستره نشان می دهد که آنزیمی وجود دارد که به سوبستره متصل است یعنی تغییر رنگ نشان می دهد که آنتی ژن وجود دارد .جهت توقف واکنش ها در هر چاهک 50MLITهیدراکسید سدیم بریزید در پایان تفسیر نتایج وجود دارد که به صورت کیفی یا کمی بیان میشود در حالت کیفی نمونه ها را با کنترل مثبت شاهد مقایسه می کنیم اگر تغییر رنگ قابل ملاحظه باشد ویروس وجود دارد در حالت کمی باید از دستگاه ELISA-READER استفاده می شود که میزان جذب نور در تک تک چاهک ها قرائت میشود.

توئین 20 پاک کننده غیر یونی میباشد که بعد از افزودن آنتی بادی ممکن است به سطح چاهک های پلیت اتصالات غیر سرولوژیکی رخ دهد twee20 از این اتصالات جلو گیری می کند



PVP polyoxye thylene soibitan morolaurate :شدت واکنش های غیر اختصاصی را کاهش می دهد به پلی فنولهایی که ممکن است ساختمان آنتی ژنی ویروس را تغییر دهند متصل میشود

آلبومین تخم مرغ BSA وژلاتین وشیر خشک بدون چربی که به آنها عوامل بلوکه میگویند . این ترکیبات با آنتی ژن های ویروسی وگیاهی جهت اشغال محل های خالق چاهک رقابت میکنند





بررسی حالت کیفی بر اساس میزان تغییر رنگ

مشکلات در رابطه با این موضوع



الف: ممکن است هیچ گونه تغییر رنگی ایجاد نشود و میزان جذب نور پایین باشد

1: دلیل آن این است که یا یکی از مراحل آزمون فراموش شده است یا مراحل به درستی پشت سر هم انجام نشده است

2: ممکن است در هر مرحله از بافر محلول آن مرحله استفاده نشده باشد

3:ممکن است آنتی بادی یا آنزیم مورد استفاده سالم نباشد

4:ممکن است بافر ایراد داشته باشد (قدیمی باشد یا آلودگی داشته باشد که برای رفع این موضوع از NaN3استفاده میشود )

5: غلظت آنتی بادی و کانژوگه درست تهیه نشده باشد





ب: تغییر رنگ غییر اختصاصی دیده میشود که چند حالت دارد

1:این تغییر رنگ ها در چاهک های اطراف پلیت مشاهده می شود برای حل این مشکل از بالا بودن رطوبت یا رطوبت انکوباتور به حد کافی مطلع باشیم

2: اگر رطوبت کمک نمیکند چاهک های حاشیه را یا استفاده نمی کنیم یا آنها را با بافر پر می کنیم

out-vow–effect ;edge-effect اثر حاشیه ای هستند اگر در کل پلیت واکنش های غیر اختصاصی دیده شود دلیل آن شستشوی ناقص است و همچنین سوبسترای آن تازه نبوده و کانژوگه به خوبی دیالیز نشده و حاوی گلوترآلدیید است ممکن است PHبافر ها تنظیم نبوده است و همچنین پلیت ها به خوبی پوشش داده نشده اند . شستن پلیت ها خیلی مهم است و ممکن است به صورت دستی یا ماشینی باشد هنگام شستن پلیت ها به صورت دستی باید به سرعت برگردانده شود به طوری که محتویات چاهک ها با هم مخلوط نشده باشند سپس پلیت ها را روی بافت جذب کننده مانند دستمال زده میشود تا محتویات باقی مانده در چاهک ها خشک شود شستشوی پلیت ها پس از افزودن عصاره کانژوگه بسیار مهم است و باید به دقت شسته شود

3: در برخی چاهک ها واکنش های غیراختصاصی دیده میشود که یا شستشو ناقص بوده یا محتویات چاهک ها با هم مخلوط شده اند باید دقت شود هنگام حمل ونقل محتویات پلیت ها با هم مخلوت نشوند





ج:تغییر رنگ بسیار سریع اتفاق می افتد و نمونه های سالم تغییر رنگ می دهند که علت آن بالا بودن غلظت کانژوگه یا سوبسترا است

تذکر : هرگز پلیت ها را به صورت خالی رها نکنید این عمل باعث کاهش حساسیت آزمون میشود و میتوانید آنها را با بافر شستشو موقتا پر کنید یا به صورت معکوس در پارچه مرطوب قرار دهیم

 

[Artmis.a]

اندازه گیری کمی :

میزان جذب نور در هر چاهک قرائت میشود معمولا شدت رنگ در طول موج 405nmاندازه گیری میشود اگر دستگاه الایزا ریدر با فیلتر های دوتایی کار کند پیشنهاد میشود در طول موج 405,492nmقرائت شود

این عمل در 405nmباعث کاهش واکنش های غیر اختصاصی میشود .

میزان جذب نور یا OD بر اساس گونه رقم و بافت مورد استفاده شن سشتسو و کیفیت مواد شیمیایی تغییر میکند به منظور تعیین نمونه آلوده به صورت کمی شما به نمونه های کنترل منفی یا سالم نیاز دارید و باید از ابتدا حد آستانه آلودگی را مشخص بکنیم و هر نمونه ای که میزان OD آن از حد آستانه بالا تر باشد آن نمونه آلوده است اگر از یک نمونه چند تکرار داشته باشیم باید متوسط جذب تکرار ها از حد آستانه بالا تر باشد تا بگوییم نمونه آلوده است . از آنجا کهغلظت پاتوژن به گونه های گیاهی واریته شرایط محیطی سن فیزیولوژیکی گیاه نوع بافت نگه داری نمونه ها ونحوه عصاره گیری بستگی دارد بنابر این پیشنهاد می شود جهت محاسبه سطح آستانه آلودگی از کنترل های مثبت و منفی همان نوع گیاه در بافتی که بررسی می کنیم استفاده شود.

بر اساس مواد مورد استفاده .خلوص مواد شیمیایی حمل ونقل پلیت ها به خصوص هنگام شستشو و شرایط انکوباسیون واکنش های غیر اختصاصی متفاوتی در پلیت ها حتی برای یک پاتوژن رخ می دهد بنابراین لازم است حد آلودگی تعیین گردد

حد آستانه آلودگی =متوسط جذب نمونه های سالم در چاهک A1-D1 *3

حد آستانه آلودگی =متوسط جذب نمونه های سالم+3برابر انحراف معیار نمونه های سالم

(که حداقل باید 5 نمونه سالم کنترل شده داسته باشیم )

بنابراین.این داده ها به شما کمک میکند که از منفی های دروغین جلوگیری کنید یعنی ممکن است یک نمونه در روش کیفی منفی در نظر گرفته شود ولی در روش کمی این نمونه مثبت خواهد شد .

حساسیت تست الایزا 1-10ng است

 

[Artmis.a]

محاسبات:



بافر پوششی برای 5سی سی

Ab=1:300

Canjoge=1:300

Na2Co3_____1.59gr=0.008gr

NaHco3_____2.9 gr=0.00145gr

NaN3_____0.2gr=0.001gr

5cc+آب مقطر300

16.5 5000 5000-16.5=4983.3 buffer

1

6.5Ml Ab



فسفات بافر سالین Phosohate buffer salin (pbs)

برای 200 سی سی

Nacl_____8gr=1.6

KHcpo4_____0.2gr=0.04

Kcl_____0.2gr=0.04

Nan3_____0.2gr =0.04

Na2HPO4_____1.15gr =0.0023



بافر شستشو Washing buffer(PBS_T)

PH=7.2 -7.4

PBS=1 lit

TWEE20_____0.5=0.075





بافر استخراجی(بافر نمونه یا بافر عصارگیری )Extra ction b. (PBS_TPO)

PBS_T=1lit____100cc

PVP=20gr_____2gr

OVAL BAMIN=2gr____0.2gr



بافر سوبسترا Substrate buffer

دی اتانول آمین =97cc___0.485

آب مقطر=800cc_____4

NaN3=0.2gr____0.01

 

[Artmis.a]

مراحل يك آزمون الايزا

مراحل انجام يك آزمون الايزا به صورت زير مي باشد:

1) جذب يك آنتي ژن يا آنتي بادي به سطوح جامد پلاستيكي كه اصطلاحا پوشش دهي ناميده مي شود.

2) افزودن نمونه هاي مورد آزمايش

3) انكوباسيون واكنشگرها براي دراختياز قراردادن مدت زمان كافي براي انجام واكنش

4) جدا نمودن واكنشگرهاي متصل شده و واكنش داده از واكنشگرهاي آزاد و متصل نشده با استفاده از عمل شستشو

5) افزودن عوامل متصل شده با آنزيم

6) انكوباسيون واكنشگرها براي دراختيار قراردادن مدت زمان كافي براي انجام واكنش

7) جدا نمودن واكنشگرهاي متصل شده و واكنش داده از واكنشگرهاي آزاد و متصل نشده با استفاده عمل شستشو

8) افزودن سوبستراي آنزيم جهت تشخيص واكنش دهنده ها

9) انكوباسيون واكنشگرها براي دراختيار قراردادن مدت زمان كافي براي انجام واكنش

10) خاتمه دادن واكنش آنزيمي توسط متوقف كننده ها و قرائت دانسيتة نوري بدست آمده توسط دستگاه اسپكتروفتومتر

 

[Artmis.a]

شرح مراحل فوق در ادامه آمده است:

3-2-2 فاز جامد

امروزه بيشتر از پليت هاي 96 خانه اي بعنوان فاز جامد استفاده مي شود. انواع انعطاف پذير و جداشدني از پلي وينيل كرايد و انواع سخت و محكم از پلي استيرن ساخته مي شوند. هم اكنون شركت هاي معتبر و متعددي به ساخت انواع مختلف پليت هاي الايزا مشغول هستند دربعضي از انواع اين پليت ها، كف چاهك ها صاف و تخت بوده و بعضي ديگر مقعر مي باشند.

بعضي از پليت ها داراي خاصيت چسبندگي بالا بوده و بعضي داراي چسبندگي متوسط مي باشند. امروزه آزمايشهاي متعددي با موفقيت با هر كدام از اين نوع پليت ها انجام مي شود و نمي توان گفت كه قطعا كدام نوع پليت برتري بر ديگر انواع پليت ها دارد. مي توان با انجام دو آزمايش الايزاي كاملا يكسان كه تنها در نوع پليت متفاوتند و بررسي نتايج تشخيص داد كه براي كدام نوع از آنتي ژن، كدام پليت بهتر است. بطور كلي پليت هايي كه انتهاي چاهك هاي آنها تخت مي باشد توصيه مي شود.

3-2-3 پوشش دهي

اين مرحله كه يكي از مهمترين مراحل آزمون الايزا مي باشد عبارتست از اتصال پروتئين آنتي ژن يا آنتي بادي بر روي پليت ,درون چاهك هاي يك پليت 96 خانه اي, كه عمدتا براساس واكنش هاي آبگريز مابين ماتريكس پلاستيكي و پروتئين مي باشد. بنابراين هر پروتئين يك ثابت اتصال متفاوتي با پليت ها دارد. اين واكنش بستگي به بار خالص پروتئين ندارد.

بنابراين افزودن هيدروفوبيسيتة واكنش پروتئين – پليت موجب بروز اين نواحي هيدروفوب در پروتئين ها شده و واكنش مابين پليت و پروتئين را مستحكم تر مي نمايد، اين دناتوره نمودن جزيي پروتئين ها توسط قراردادن پروتئين در معرض دترژنت هاي ملايم و مواد داراي pH پائين حاصل مي شود كه بعد از اين مجاورت مي توان با استفاده از يك روش دياليز مناسب، بافر پوشش دهي را با اين مواد دناتوره كننده تعويض نمود.

عمل پوشش دهي به عوامل زير بستگي دارد.

الف) مدت زمان پوشش دهي

ب) دما

ج) غلظت پروتئين هايي كه بايد پوشش داده شوند.

د) نسبت سطح چاهك ها به حجم محلول پوشش دهي

هـ) ضريب انتشار مولكولهاي پروتئيني درون محلول پوشش دهي درون چاهك ها

عوامل فوق يكپارچه بوده و جداي از يكديگر نيستند. يكي از مهمترين موارد بدست آوردن غلظت مناسب از پروتئين براي اتصال مناسب به پليت مي باشد كه از طريق تيتراسيون پروتئين بدست مي آيد.

محدودة 1 تا 10 μg/ml در حجم 50μl يك راهنمايي خوبي براي بدست آوردن غلظت مناسب اغلب پروتئين ها جهت اتصال خوب به پليت مي باشد البته اين محدوده وابستگي به خلوص نسبي پروتئين موردنظر جهت پوشش دهي دارد بنابراين غلظت يك پروتئين جهت پوشش دهي وابسته به فعاليت آن پروتئين مي باشد مشخص است كه يك محلول پروتئيني كه داراي مقدار كمي از پروتئين موردنظر باشد مقدار اتصال آن پروتئين به پليت برطبق نسبت حضور آن پروتئين در محلول كم مي باشد و ناخالصي هاي موجود در محلول پروتئيني سطوحي را كه بايد پروتئين موردنظر ما در اختيار داشته باشد اشغال مي نمايند كه در نهايت منجر به يك اندازه گيري ضعيف مي شود.

با استفاده از چند تست الايزا كه در آنها غلظت پروتئين موردنظر براي پوشش دهي متفاوت است مي توان به يك غلظت مناسب از پروتئين جهت پوشش دادن دست يافت. توجه به اين مطلب مهم است كه دانسيتة اتصال پروتئين به پليت درنتيجة نهايي بسيار مهم است. اتصال با دانسيتة بالا حتي ممكن اسب برخلاف انتظار ما به نتايج ضعيف منجر شود چرا كه اين دانسيتة بالا مي تواند از لحاظ قضايي اجازة نزديك شدن پروتئين دوم (آنتي ژن يا آنتي بادي) را به پروتئين پوشش داده شده ندهد. درحقيقت مولكولهاي پروتئين پوشش داده شده آنقدر باشدت و استحكام بالايي (و بينابين يكديگر) به سطح چاهك متصل شده اند كه حتي جايگاه هاي اتصالشان در دسترس اتصال به پروتئين دوم (فرضا آنتي بادي) نمي باشد.

غلظت هاي بالاي پروتئيني كه بايد پوشش داده شود نيز منجر به همين مسئله مي شود. رابطه غلظت يك آنتي ژن يا آنتي بادي با چگالي نوري (OD) بدست آمده در مرحلة نهايي تست الايزا يك رابطة خطي صرف نمي باشد و براي هر پروتئيني بسته به فرم فضايي آن پروتئين و نيز در هر محدوده اي از غلظت هاي مختلف آن پروتئين متفاوت مي باشد.

ميزان هيدروفوبيسيتة واكنش پروتئين – پليت وابسته به دما نيز مي باشد افزايش دما موجب افزايش اين هيدروفوبيسته مي شود و دانستيم كه اين افزايش منجر به اتصال مستحكم تر پروتئين به پليت مي شود يكي از رايج ترين روش هاي پوشش دهي از لحاظ دما، در مجاورت قراردادن پليت با پروتئين در دماي 37°c مي باشد كه در اين دما بين 1 تا 3 ساعت زمان مناسبي براي اغلب پروتئين ها مي باشد در مرتبة بعد مي توان روش پوشش دهي در طول شب در 4°c و يا تركيبي از ايندو را بكار گرفت.

بسته به ماهيت پروتئين ها، گاهي اوقات پوشش دهي در دماي آزمايشگاه با مدت زمان طولاني تر موردنظر قرار مي گيرد.

البته مشخص است كه افزايش دما در مدت زمان طولاني ممكن است باعث تغييراتي در ساختار پروتئين موردنظر جهت اتصال به پليت شود. تكان دادن يكنواخت، آرام و منظم پليت نيز مي تواند با افزايش ميزان برخورد و درنتيجه اتصال پروتئين به پليت، زمان موردنظر براي پوشش دهي را كاهش دهد.

3-2-3-1 بافر پوشش دهي

بيشترين بافرهايي كه هم اكنون مورد استفاده قرار مي گيرند عبارتند از :

بافر كربنات 6/9 = pH با كربنات 50 ميلی مولار،

Tris – Hcl بيست ميلی مولار با pH = 8/5 و يا

PBS 10 ميلی مولار با pH = 7/2

اغلب روش هاي الايزا از يكي از اين سه نوع بافر استفاده مي نمايند.

بافرهايي غير از موارد فوق هنگامي مورد استفاده قرار مي گيرند كه مشكلي در پوشش دهي با بافرهاي فوق بوجود آمده باشد. از لحاظ تئوري بهترين بافري كه مورد استفاده قرار مي گيرد بافري است كه داراي pH برابر با 1 تا 2 واحد بالاتر از (PI) پروتئين اتصالي باشد. اما درعمل اندازه گيري اين مطلب آسان نمي باشد چراكه پروتئين اتصالي (فرضا آنتي ژن) حاوي مخلوطي از پپتيدهاي متفاوت مي باشد. با انجام چند آزمايش الايزا كه pH هاي متفاوت و قدرت يوني متفاوتي در بافر پوشش دهي داشته باشد مي توانيم اتصال بهتر و مناسب تر پروتئين به پليت را بدست آوريم.

پروتئين هاي با خاصيت اسيدي، احتياج به يك pH پائين تر جهت خنثي نمودن نيروي دافعه مابين پروتئين و پليت دارند و در آزمايشي جهت پوشش دادن پروتئين هاي ويروس Herpes simplex كه خاصيت اسيدي دارند بهترين pH در محدودة 5/2 تا 6/4 بدست آمده است.

در روش هاي رايج امروزي پوشش دادن با بافر PBS يا كربنات اغلب موفقيت آميز است.

گاهي اوقات بعضي از آنتي ژن ها مشكلاتي را در پوشش دهي بوجود مي آورند اين آنتي ژن ها شامل پلي ساكاريدها ليپوپلي ساكاريدها و گليكوليپيدها هستند كه پوشش دهي مستقيم را منجر به نتايج ضعيف و نامناسب مي نمايند در اينگونه موارد يك پوشش دهي ابتدايي موردنياز است كه با يك آنتي سرم اختصاصي انجام مي شود كه يك حالت ساندويچي را بوجود مي آورد كه در ادامة همين فصل توضيح داده خواهد شد.

بنابراين مخلوط تخليص نشده آنتي ژن ها مناسب براي پوشش دهي مستقيم نمي باشد و درصورت نياز از الايزاي ساندويچي استفاده مي شود.

بدليل ماهيت غير كووالانسي اتصالي پروتئين به پليت، جداشدن يك پروتئين از پليت نيز ممكن است رخ دهد اما اگر شرايط پايدار و استاندارد باشد اين مطلب تأثير مهمي در يك آزمون الايزا نخواهد گذاشت.

 

[storm]

حدیث خانوم واقعا ممنون . مطلب خییییییییییییییییییلی خوبی بود.:applause:

 

[Artmis.a]

Test principle

 

[Artmis.a]

حدیث خانوم واقعا ممنون . مطلب خییییییییییییییییییلی خوبی بود.

سلام ممنون

یکی از روش هایی که برای تز باید ازش استفاده کنم الایزاست:auizz3ffy9vla57584x

مطالب فارسی راجع بهش پیدا کردم گفتم میذارم اینجا که هم برای خودم جمع بندی بشه هم بچه ها استفاده کنن:rose::smilies-azardl (113

ولی به همه پیشنهاد میکنم تزهایی رو بردارن که توش الایزا نباشه چون هم خیلی حساس و پر دردسره هم پرهزینه!!!!!

فقط یه کیت الایزا درحال حاضر 2250000 تومان میشه :black_eyed:

 

[storm]

ببخشید چون جواب چند تا از سوالامو گرفتم زودتر از اینکه مطالبتون تموم شه نظر گذاشتم.
ببخشید میشه منبعش رو ازتون بپرسم؟

 

[Artmis.a]

خواهش میکنم

منبع:
همه چیز در مورد تست الایزا ELISA - Neurologists

تست الایزا | خبرگزاری پردیس

 

[MR3za]

توی اروپا یک تست روتین هست و توی ایران با این وضعیت ارزش پول باعث شده تست گرونی باشه!

 

[elissa 2]

عالی بود... ممنون