waria
New member
نیازمندی به یک سلول زنده پیکر میزبان برای تکثیر ویروسها ، مشاهده ، شمارش و تشخیص آنها را مشکل می*سازد. برای تکثیر ویروسها به جای محیطهای شیمیایی ساده بایستی سلولهای زنده فراهم شود. تهیه گیاهان و جانوران زنده برای نگهداری ویروسها ، دشوار و پر هزینه بوده و به علاوه ویروسهای بیماریزایی که فقط در پریماتهای عالی و انسان رشد می*کنند مشکلات بیشتری را نیز فراهم می*نمایند و از طرف دیگر ، ویروسهای باکتریها (باکتریوفاژها) را می*توان با پرورش آنها بر روی کشت باکتریها به آسانی تهیه کرد.
و از این رو است که قسمت اعظم اطلاعات بدست آمده در مورد تکثیر ویروسها از مطالعه این دسته از ویروسها بدست آمده است. بسیاری از ویروسها قادرند در کشتهای سلولی یا در تخم مرغهای جنین*دار در شرایط کاملا کنترل شده*ای تکثیر یابند. آزمایشگاههای تشخیصی سعی دارند به منظور اثبات عامل بیماری ، ویروسها را از نمونه*های کلینیکی بدست آورند. آزمایشگاههای تحقیقاتی برای بررسی و تحلیل دقیق تکثیر و چگونگی تظاهر ژنهای ویروس ، آنها را کشت می*دهند
رشد باکتریوفاژها در شرایط آزمایشگاه
ویروسهای باکتریایی را می*توان در سوسپانسیون باکتریها در محیط آبکی یا در کشت باکتریها در محیط سخت ، پرورش داد. بکار بردن محیط سخت ، پیدایش پلاک و مشاهده و شمارش ویروسها را با بکاربردن مواد و وسایل ساده میسر می*سازد. در این روش نمونه*ای از باکتریوفاژ را با باکتری میزبان و آگار ذوب شده مخلوط می*کنند، سپس این مخلوط را در یک جعبه پتری ریخته و می*گذارند تا به صورت یک لایه سفت شود. مخلوط ویروس- باکتری به صورت یک لایه سفت درمی*آید.
هر ذره ویروسی در داخل یک باکتری تکثیر یافته و پس از پاره شدن دیواره باکتری ، صدها ویروس تازه از آن رها می*شود و این ویروسها به باکتریهایی دیگر حمله می*کنند و به ترتیب ، همه باکتریها در نواحی اطراف ویروس اولیه از بین می*روند. با این فرایند ، در سطح آگار نواحی شفافی به نام پلاک به تعداد زیاد در زمینه پر از باکتریها به چشم می*خورد. تراکم سوسپانسیون ویروسی را با شمارش پلاکها ، اندازه گیری می*کنند.
رشد ویروسهای جانوری در شرایط آزمایشگاه
برخی از ویروسهای جانوری را می*توان منحصرا در بدن حیوانات زنده نظیر موش ، خرگوش و خوکچه هندی پرورش داد. اکثر تجربیات مربوط به مطالعه واکنشهای ایمنی نسبت به عفونتهای ویروسی نیز باید در بدن حیوانات آلوده شده انجام گیرد. بطور کلی تلقیح حیوانات برای تشخیص ویروسها در نمونه*های بالینی مورد استفاده قرار می*گیرد. به دنبال آلوده کردن حیوان با ویروسها ، آنها را باید از نظر پیدایش بیماری مورد بررسی قرار دارد یا حیوان را کشته و از بافتهای آلوده برای بررسی و ارزیابی قدرت بیماریزایی ویروس استفاده نمود.
رشد ویروسهای جانوری در تخم مرغ جنین*دار
در پوسته خارجی تخم مرغ جنین*دار سوراخی تعبیه کرده و از آن راه سوسپانسیون ویروس را در مایعات تخم مرغ تزریق می*کنند. در تخم مرغ چندین غشا وجود دارد که می*توان بر روی آنها ویروسها را پرورش داد. رشد ویروس را از روی مرگ جنین یا آسیب دیدن سلولهای جنینی می*توان مشاهده کرد. این روش امروزه برای پرورش ویروسها به منظور تهیه واکسن بکار برده می*شود.
کشت سلولی
استفاده از تکنیکهای کشت سلولی موجب شده است که شناسایی و کشت ویروسهای ایزوله شده جدید و خصوصیات ویروسهای شناخته شده قبلی آسان شود. سه نوع کشت سلولی وجود دارد. کشتهای سلولی اولیه که می*توان با پراکنده نمودن سلولهایی از نمونه*های بافتی که به تازگی تهیه شده*اند با آنزیم تریپسین فراهم نمود. این سلولها بعد از چند بار کشت قادر به رشد نیستند، و کشتهای سلولی ثانویه و کشت سلولی مداوم که به تعداد نامحدود رشد می*کنند. نوع کشت سلولی مورد استفاده در کشت ویروس به حساسیت سلولها نسبت به ویروس مورد نظر بستگی دارد.
روشهای تشخیص سلولهای آلوده به ویروس
پیدایش اثر سیتوپاتیک
اثر سیتوپاتیک بر اثر تغییرات مورفولوژی در سلولهای آلوده به ویروس رخ می*دهد. متلاشی شدن سلول ، نکروز سلولی ، تشکیل اجسام درون سلولی ، تشکیل سلولهای غول پیکر و تشکیل حفرات سیتوپلاسمی ، نمونه*هایی از اثرات سیتوپاتیک هستند که توسط ویروسها ایجاد می*شوند.
پیدایش پروتئینهای کد شده ویروس
از آنتی سرمهای اختصاصی می*توان برای مشاهده سنتز پروتئینهای ویروس در سلولهای آلوده استفاده کرد.
مشاهده اسیدنوکلئیک خاص ویروس
آزمایشهای مولکولی مانند واکنش زنجیر پلی مراز (pcr) روشی اختصاصی ، حساس و سریع را برای مشاهده ویروس فراهم کرده است.
اندازه گیری مقدار ویروسها
روشهای فیزیکی
با کمک یک محلول استاندارد ازذرات لاتکس که اندازه کوچک و یکسانی دارند می*توان ذرات ویروس را در زیر میکروسکوپ الکترونی شمرد. در این روش ، محلول تقریبا غلیظی از ویروس مورد نیاز است. برای تعیین مقدار ویروس موجود در یک نمونه می*توان از آزمایشهای سرولوژیکی گوناگونی نظیر رادیو ایمونواسی (ria) و آزمایش الیزا (elisa) استفاده کرد.
روشهای بیولوژی
نقطه پایان آزمایشهای بیولوژی به میزان مرگ و عفونت در حیوانات یا به اثرات سیتوپاتیک در کشتهای سلولی به غلظتهای مختلف ویروس مورد آزمایش بستگی دارد. برای اکثر ویروسهای عفونی از آزمایش پلاک استفاده می*شود.
خالص نمودن ویروسها
ویروس خالص به منظور مطالعه خصوصیات و بررسی مولکولی آن مورد نیاز است. برای خالص کردن ویروسها معمولا حجم زیادی از محیط کشت سلولی ، مایعات بدن یا سلولهای آلوده را بکار می*برند. در اولین مرحله ، ذرات ویروس را بوسیله سولفات آمونیوم تغلیظ می*کنند. هنگامی که غلظت ویروس زیاد است، آن را بوسیله سانتریفوژ افتراقی ، کروماتوگرافی ستونی و الکتروفورز از مواد دیگر جدا می*کنند.
ایمنی در آزمایشگاه
برخی از ویروسها ، پاتوژنهای انسانی هستند و عفونت گاهی از آزمایشگاه حاصل می*شود. تکنیکهای آزمایشگاهی چنانچه بطور کامل مراعات نشود، اغلب پر خطر هستند. راههایی که کارکنان آزمایشگاه را در خطر عفونت قرار می*دهد شامل موارد زیر است، از طریق ذرات هوا ، از طریق دستگاه گوارش ، از طریق نفوذ به پوست و از طریق پخش شدن مایعات آلوده و ریختن آنها در چشمها
و از این رو است که قسمت اعظم اطلاعات بدست آمده در مورد تکثیر ویروسها از مطالعه این دسته از ویروسها بدست آمده است. بسیاری از ویروسها قادرند در کشتهای سلولی یا در تخم مرغهای جنین*دار در شرایط کاملا کنترل شده*ای تکثیر یابند. آزمایشگاههای تشخیصی سعی دارند به منظور اثبات عامل بیماری ، ویروسها را از نمونه*های کلینیکی بدست آورند. آزمایشگاههای تحقیقاتی برای بررسی و تحلیل دقیق تکثیر و چگونگی تظاهر ژنهای ویروس ، آنها را کشت می*دهند
رشد باکتریوفاژها در شرایط آزمایشگاه
ویروسهای باکتریایی را می*توان در سوسپانسیون باکتریها در محیط آبکی یا در کشت باکتریها در محیط سخت ، پرورش داد. بکار بردن محیط سخت ، پیدایش پلاک و مشاهده و شمارش ویروسها را با بکاربردن مواد و وسایل ساده میسر می*سازد. در این روش نمونه*ای از باکتریوفاژ را با باکتری میزبان و آگار ذوب شده مخلوط می*کنند، سپس این مخلوط را در یک جعبه پتری ریخته و می*گذارند تا به صورت یک لایه سفت شود. مخلوط ویروس- باکتری به صورت یک لایه سفت درمی*آید.
هر ذره ویروسی در داخل یک باکتری تکثیر یافته و پس از پاره شدن دیواره باکتری ، صدها ویروس تازه از آن رها می*شود و این ویروسها به باکتریهایی دیگر حمله می*کنند و به ترتیب ، همه باکتریها در نواحی اطراف ویروس اولیه از بین می*روند. با این فرایند ، در سطح آگار نواحی شفافی به نام پلاک به تعداد زیاد در زمینه پر از باکتریها به چشم می*خورد. تراکم سوسپانسیون ویروسی را با شمارش پلاکها ، اندازه گیری می*کنند.
رشد ویروسهای جانوری در شرایط آزمایشگاه
برخی از ویروسهای جانوری را می*توان منحصرا در بدن حیوانات زنده نظیر موش ، خرگوش و خوکچه هندی پرورش داد. اکثر تجربیات مربوط به مطالعه واکنشهای ایمنی نسبت به عفونتهای ویروسی نیز باید در بدن حیوانات آلوده شده انجام گیرد. بطور کلی تلقیح حیوانات برای تشخیص ویروسها در نمونه*های بالینی مورد استفاده قرار می*گیرد. به دنبال آلوده کردن حیوان با ویروسها ، آنها را باید از نظر پیدایش بیماری مورد بررسی قرار دارد یا حیوان را کشته و از بافتهای آلوده برای بررسی و ارزیابی قدرت بیماریزایی ویروس استفاده نمود.
رشد ویروسهای جانوری در تخم مرغ جنین*دار
در پوسته خارجی تخم مرغ جنین*دار سوراخی تعبیه کرده و از آن راه سوسپانسیون ویروس را در مایعات تخم مرغ تزریق می*کنند. در تخم مرغ چندین غشا وجود دارد که می*توان بر روی آنها ویروسها را پرورش داد. رشد ویروس را از روی مرگ جنین یا آسیب دیدن سلولهای جنینی می*توان مشاهده کرد. این روش امروزه برای پرورش ویروسها به منظور تهیه واکسن بکار برده می*شود.
کشت سلولی
استفاده از تکنیکهای کشت سلولی موجب شده است که شناسایی و کشت ویروسهای ایزوله شده جدید و خصوصیات ویروسهای شناخته شده قبلی آسان شود. سه نوع کشت سلولی وجود دارد. کشتهای سلولی اولیه که می*توان با پراکنده نمودن سلولهایی از نمونه*های بافتی که به تازگی تهیه شده*اند با آنزیم تریپسین فراهم نمود. این سلولها بعد از چند بار کشت قادر به رشد نیستند، و کشتهای سلولی ثانویه و کشت سلولی مداوم که به تعداد نامحدود رشد می*کنند. نوع کشت سلولی مورد استفاده در کشت ویروس به حساسیت سلولها نسبت به ویروس مورد نظر بستگی دارد.
روشهای تشخیص سلولهای آلوده به ویروس
پیدایش اثر سیتوپاتیک
اثر سیتوپاتیک بر اثر تغییرات مورفولوژی در سلولهای آلوده به ویروس رخ می*دهد. متلاشی شدن سلول ، نکروز سلولی ، تشکیل اجسام درون سلولی ، تشکیل سلولهای غول پیکر و تشکیل حفرات سیتوپلاسمی ، نمونه*هایی از اثرات سیتوپاتیک هستند که توسط ویروسها ایجاد می*شوند.
پیدایش پروتئینهای کد شده ویروس
از آنتی سرمهای اختصاصی می*توان برای مشاهده سنتز پروتئینهای ویروس در سلولهای آلوده استفاده کرد.
مشاهده اسیدنوکلئیک خاص ویروس
آزمایشهای مولکولی مانند واکنش زنجیر پلی مراز (pcr) روشی اختصاصی ، حساس و سریع را برای مشاهده ویروس فراهم کرده است.
اندازه گیری مقدار ویروسها
روشهای فیزیکی
با کمک یک محلول استاندارد ازذرات لاتکس که اندازه کوچک و یکسانی دارند می*توان ذرات ویروس را در زیر میکروسکوپ الکترونی شمرد. در این روش ، محلول تقریبا غلیظی از ویروس مورد نیاز است. برای تعیین مقدار ویروس موجود در یک نمونه می*توان از آزمایشهای سرولوژیکی گوناگونی نظیر رادیو ایمونواسی (ria) و آزمایش الیزا (elisa) استفاده کرد.
روشهای بیولوژی
نقطه پایان آزمایشهای بیولوژی به میزان مرگ و عفونت در حیوانات یا به اثرات سیتوپاتیک در کشتهای سلولی به غلظتهای مختلف ویروس مورد آزمایش بستگی دارد. برای اکثر ویروسهای عفونی از آزمایش پلاک استفاده می*شود.
خالص نمودن ویروسها
ویروس خالص به منظور مطالعه خصوصیات و بررسی مولکولی آن مورد نیاز است. برای خالص کردن ویروسها معمولا حجم زیادی از محیط کشت سلولی ، مایعات بدن یا سلولهای آلوده را بکار می*برند. در اولین مرحله ، ذرات ویروس را بوسیله سولفات آمونیوم تغلیظ می*کنند. هنگامی که غلظت ویروس زیاد است، آن را بوسیله سانتریفوژ افتراقی ، کروماتوگرافی ستونی و الکتروفورز از مواد دیگر جدا می*کنند.
ایمنی در آزمایشگاه
برخی از ویروسها ، پاتوژنهای انسانی هستند و عفونت گاهی از آزمایشگاه حاصل می*شود. تکنیکهای آزمایشگاهی چنانچه بطور کامل مراعات نشود، اغلب پر خطر هستند. راههایی که کارکنان آزمایشگاه را در خطر عفونت قرار می*دهد شامل موارد زیر است، از طریق ذرات هوا ، از طریق دستگاه گوارش ، از طریق نفوذ به پوست و از طریق پخش شدن مایعات آلوده و ریختن آنها در چشمها