Realtime PCR

[mojnia]

دانلود فایل :
PCR Cloning (II)- Digestion

 

[mojnia]

دانلود فایل :
PCR Cloning (III)- Ligation

 

[mojnia]

این هم یک پاورپوینت در خصوص رئال تایم پی سی آر از انیستیتو پاستور

دانلود فایل :
Summerschool Overview of Real-time PCR

 

[mojnia]

pcr coloning

دانلود فایل :
PCR CLONING

 

[amir.sd]

کتاب مک فرسون-مولر خوبه ، ترجمه شده; نشر آییژ

ممنونم از راهنماییتون،تشکر

 

[amir.sd]

خواهش میکنم،ولی نگفتم استاد هستم

شکست نفسی نفرمایید استاد:riz277:

 

[amir.sd]

دست گل کروموزوم درد نکنه، کروموزوم اگه حالشو داشتی یه کم جزئی تر توضیح بده تا یه کم یاد بگیریم، مرسی

خواهش میکنم، وظیفه ست. به نظرم بهتره اول یه نگاه به این فایل هایی که دوستامون براتون گذاشتن بندازین تا از لحاظ تئوری موضوع بیاد دستتون؛ چون من کاملا عملی براتون توضیح میدم که بتونین راحت تکنیکو انجام بدین. اگه تئوریشو ندونین یکم درکش براتون سخت میشه

تشکر کروموزوم ، درسته اینجوریه اول باید تئوریشو بدونم ، چشم ، اول مطالعه میکنم بعدش سوالمو میپرسم

- - - Updated - - -

مرسی mojnia واقعا خیلی زحمت کشیدی

 

[biotechnologist]

منم ریل تایم داشتم. از 10 تا ژن 8 تاشو گذاشتم تموم شد رفت پی کارش.دوتای دیگه هم پرایمرهاش برسه میذارم.خدارو شکر چندتا از ژن ها افزایش بیان داشت. پرایمرها رو هم خودمون طراحی کردیم بعد استاد راهنمامون اصلاحشون کرد بعضی هارو هم تغییر داد. کارگاه ریل تایم و طراحی پرایمر هم گذاشتیم. کلا خیلی خوب بود جز اینکه استخراج rna از سلول ها یه ذره دردسر داشت البته نه واسه من. چون اگر od پایین میشد کلی طول میکشید تا چند تا فلاسک سلول کشت بدیم و دوباره ببریم واسه استخراج.

 

[Chromosome]

منم ریل تایم داشتم. از 10 تا ژن 8 تاشو گذاشتم تموم شد رفت پی کارش.دوتای دیگه هم پرایمرهاش برسه میذارم.خدارو شکر چندتا از ژن ها افزایش بیان داشت. پرایمرها رو هم خودمون طراحی کردیم بعد استاد راهنمامون اصلاحشون کرد بعضی هارو هم تغییر داد. کارگاه ریل تایم و طراحی پرایمر هم گذاشتیم. کلا خیلی خوب بود جز اینکه استخراج rna از سلول ها یه ذره دردسر داشت البته نه واسه من. چون اگر od پایین میشد کلی طول میکشید تا چند تا فلاسک سلول کشت بدیم و دوباره ببریم واسه استخراج.

امیدوارم همینجوری کارا خیلی خیلی خوب پیش بره :a2d3:
اگه منظورتون از od همون ratio ست، ratio پایین یعنی آلودگی با DNA دارین که این آلودگی رو با یه DNase treatment قبل از سنتز cDNA میشه برطرف کرد.به احتمال زیاد دیگه نیازی به کشت دوباره نیست

- - - Updated - - -

منم ریل تایم داشتم. از 10 تا ژن 8 تاشو گذاشتم تموم شد رفت پی کارش.دوتای دیگه هم پرایمرهاش برسه میذارم.خدارو شکر چندتا از ژن ها افزایش بیان داشت. پرایمرها رو هم خودمون طراحی کردیم بعد استاد راهنمامون اصلاحشون کرد بعضی هارو هم تغییر داد. کارگاه ریل تایم و طراحی پرایمر هم گذاشتیم. کلا خیلی خوب بود جز اینکه استخراج rna از سلول ها یه ذره دردسر داشت البته نه واسه من. چون اگر od پایین میشد کلی طول میکشید تا چند تا فلاسک سلول کشت بدیم و دوباره ببریم واسه استخراج.

امیدوارم همینجوری کارا خیلی خیلی خوب پیش بره :a2d3:
اگه منظورتون از od همون ratio ست، ratio پایین یعنی آلودگی با DNA دارین که این آلودگی رو با یه DNase treatment قبل از سنتز cDNA میشه برطرف کرد.به احتمال زیاد دیگه نیازی به کشت دوباره نیست

 

[Chromosome]

تشکر کروموزوم ، درسته اینجوریه اول باید تئوریشو بدونم ، چشم ، اول مطالعه میکنم بعدش سوالمو میپرسم

- - - Updated - - -

خواهش میکنم؛من در خدمتم

 

[biotechnologist]

امیدوارم همینجوری کارا خیلی خیلی خوب پیش بره :a2d3:
اگه منظورتون از od همون ratio ست، ratio پایین یعنی آلودگی با DNA دارین که این آلودگی رو با یه DNase treatment قبل از سنتز cDNA میشه برطرف کرد.به احتمال زیاد دیگه نیازی به کشت دوباره نیست

- - - Updated - - -


امیدوارم همینجوری کارا خیلی خیلی خوب پیش بره :a2d3:
اگه منظورتون از od همون ratio ست، ratio پایین یعنی آلودگی با DNA دارین که این آلودگی رو با یه DNase treatment قبل از سنتز cDNA میشه برطرف کرد.به احتمال زیاد دیگه نیازی به کشت دوباره نیست

چون بیان ژن هامون پایینه نمیشه از Dnase استفاده کرد چون به خود RNA هم ممکنه آسب بزنه واسه همین اصلا گروه ما OD های زیر 1.6 رو قبول نمی کنن که باهاش کار کنید.RNA رو روی ژل run کردم آلودگی نداشت. احتمالا ایزوپروپانول روی پلت خوب خشک نشده بوده و OD رو پایین آورده چون دفعه دوم که انجام دادم OD 1.83 داشت.

 

[Chromosome]

احیانا روی ILها کار نمیکنین؟
خیلی هم عالی؛آره ایزوپروپانول RNA رو degrade میکنه.
ان شاءالله موفق باشین

 

[amir.sd]

من در مورد Real time pcr مطالعه ای کردم،بچه ها پروتکل اش اینجوریه: در تیوبهای مخصوص ریل تایم پی سی آر 1 ماکرولیترماکرولیتر cDNA و 19 ماکرولیتر مستر میکس حاوی 1 ماکرولیتر پرایمر فوروارد ، 1ماکرولیتر پرایمر ریورز ، 7 ماکرولیتر DEPC و 10 ماکرولیتر Mastermix 2x Real time میریزیم،حجم نهایی مان باید 20 ماکرولیتر شود.بعد میخوام بدونم باید ژن HOUSE keeping مونو باید رقت سازی کنیم؟ چطوری؟ بعد به هر تیوب چقدر سایبرگرین میریزیم؟ البته من میخوام از سایبرگرین استفاده کنم ؟

 

[Chromosome]

کلا باید اول کارتو optimize کنی؛ یعنی تو هر run باید مقادیر و دما رو انقدر کم و زیاد کنی تا دستگاه بهترین curve رو بهت بده.بیشترین وقتتم برای real سر همین optimize کردن میره.(اگه دستگاهتون gradiant داشته باشه میتونی تو یه optimize ،run کنی)
بستگی به این که از چه کیتی استفاده میکنی(cybr green یا eva green یا ...) مقدار master mix فرق میکنه.مثلا تو اکثر کیت های cybr حجم کلی رو up to 50lµ در نظر گرفته و مقدار cybr که باید استفاده کنی رو 25µl زده.پس باز هم بسته به اینکه از میکروتیوب 0.2 استفاده میکنی یا 0.1 (که این هم به دستگاه real time و مقدار مواد موجودت بستگی داره)با یه تناسب ساده مقدار مناسب برای کارتو بدست میاری(حجم کلی reaction در 0.2 20µl و در 0.1 10µl میتونه باشه). ولی بقیه ی موارد شامل primer وsample رو اول بر اساس تجربه و بعد با توجه به curve و آنالیز اون کم یا زیاد میکنی.
پس مثلا برای ساختن reaction در میکروتیوب 0.1 با cybr green:
cybr 5µl
sample (cDNA) 1µl
primer forward 0.5µl
primer reverse 0.5µl
و با depc water به حجم 10µl میرسونی.

 

[Chromosome]

همه ی ژن ها از جمله house keeping باید رقیق بشن. معمولا شرکت ها پرایمرها رو تو یه کرایوتیوب به صورت لیوفیلیزه میفرستن که مقدار آب مورد نیاز برای رسوندن به رقت 100pmol رو روی خود کرایوتیوب نوشته.بعد از اضافه کردن آب مورد نیاز، حالا باید این 100pmol رو 10 یا 5pmol کنی که اونم باید optimize شه که معمولا 10pmol خوب جواب میده
10pmol رو حتما تو یه میکروتیوب استریل دیگه درست کن تا موقع کار هی freeze defreeze نشه

 

[سلولی]

سلام یک سوال در یک کار تحقیقاتی قرار است یک پروتئین هم درسطح ژنی با Real time pcr ودر سطح پروتئینی با ایمونوهیستوشیمی اندازه گیری شود چرا باید در هر دو سطح اندازه گیری شود؟