PCR)Asymmetric PCRنامتقارن):
هدف از بكارگيري اين روش توليد DNAتك رشته اي است.در اين روش يكي از پرايمرها به تعداد كمتر و پرايمر ديگر به تعداد بيشتر به محيط واكنش اضافه مي شودتا جائيكه اين نسبت 1:50 يا 1:100 برسد.در حدود 20 چرخه ابتداييPCR محصول دو رشته اي به صورت فاز نمايي توليد مي گردداما پس از 20 چرخه كه غلظت پرايمر كمتر در واكنش قابل چشم پوشي است وبه عبارت عاميانه تر به دليل تمام شدن پرايمر با غلظت كمتر در چرخه هاي بعدي PCR فقط يك رشته از الگو به صورت خطي تكثير مي شود.پس از پايان PCRچند نسخه DNA دو رشته اي و تعداد زيادي DNA تك رشته اي از ژن مورد نظر ايجاد خواهد شد.
ARMS PCR)Amplification Refractory Mutation System):
اين روش تحت عنوان تكثير اختصاصي اللها با PCR نيز ناميده ميشود.اين روش براي تشخيص موتاسيون هاي نقطه اي به كار مي رودوجهت تشخيص اللهاي طبيعي و جهش يافته طراحي شده است.اين روش بر پايه تفاوت نوكلئوتيد انتهاي 3َ پرايمرهايي است كه براي اللهاي مختلف طراحي شده استدو واكنش PCR با استفاده از يك DNA الگودر2 لوله جداگانه انجام مي شود كه يكي از آنها حاوي پرايمرهاي جهش يافته و ديگري حاوي پرايمر طبيعي مي باشددر هرواكنش پرايمر مشترك به همراه يكي از 2 پرايمراختصاصي الل مورد استفاده قرارميگيرد.حالت اختصاصي پرايمرهابراي هريك ازاللها ناشي از نوكلئوتيد انتهاي 3َ آنهاست كه با هم متفاوت بوده.چنانچه پليمريزاسيون در لوله حاوي پرايمر طبيعي انجام شود نشان دهنده نبود جهش نقطه اي در باز مورد نظراست واگر پليمريزاسيون در لوله حاوي پرايمر جهش يافته انجام شود نشان دهنده حضور جهش نقطه اي در باز مورد نظر است.نكته مهم اين است كه از DNAپليمرازي كه فاقد خاصيت تصحيح كنندگي اگزونوكلئازي َ5َ à 3َ است،استفاده شودزيرا استفاده از يك آنزيم اصلاحگر باعث برداشتن باز جفت نشده انتهاي 3َ ميگردد و در واقع توانايي متمايز كردن دو الل از بين ميرود. از اين روش در تشخيص موتاسيون هاي مولد مقاومت دارويي در باكتري ها استفاده مي شود.
Hot-Start PCR:
زمانيكه بهترين شرايط اتصال فراهم شود باندهاي غير اختصاصي ممكن است قبل از انجام اولين چرخه PCR ايجاد شودحتي تاوقتيكه دماي لوله ها تا°C70-°C65 افزايش مي يابد اتصالات غير اختصاصي پرايمر/پرايمر و پرايمر/ الگوممكن است بوجود آيد و بعنوان سوبستراي اوليه براي DNAپليمراز عمل كند.ساده ترين روش براي جلوگيري ازچنين اتصالات اوليه غيراختصاصي وبهتركردن شرايط اتصال صحيح پرايمر،استفاده از روش Hot start است كه اساس اين روش بر جدا كردن فيزيكي مواد واكنش تا زمان رسيدن به دماي بالا مي باشد.يك يا چندماده قبل از رسيدن به دماي بالاتر از °C70 از واكنش جدا مي شود و پس از رسيدن به دماي بالا در واكنش وارد مي كنند.ارزان ترين روش اضافه كردن تمامي مواد واكنش به جز DNA پليمراز است.اين روش براي تعداد زياد نمونه ها به دلايل زيرامكان پذير نيست:1-زمان مورد نياز براي اضافه كردن آنزيم به هرلوله زياد است.2-اشتباه هاي ناشي از عدم تمركز حواس كه باعث اضافه نكردن آنزيم به يك يا چند لوله ميشود .3 -احتمال آلودگي لوله ها به دليل باز شدن در آنها. براي حل اين مشكل وتسهيل انجام PCRگرم آغاز يك سري محصولات تجاري عرضه شده است.مثل Ampliwax Gemsكه گلوله هاي مومي با فرمول خاص ميباشند. يك عدداز آن را در لوله هاي حاوي پرايمر،dNTPs(دئوكسي نوكلئوتيد تري فسفات)،Mg++ اضافه كرده و واكنش در يك ترموسايكلر در دماي °C80-°C75 به مدت 10-5 دقيقه نگهداري ميشود تا موم ذوب شود سپس لوله ها تا زير°C35 سرد ميشودتا موم مجددا جامد شودو يك لايه محافظ بر روي مواداوليه واكنش تشكيل شود.موادديگر واكنش از قبيل DNAالگو،DNAپليمراز و بافر را ميتوان بر روي لايه موم ريخت و سپس PCR را آغاز كرد.در هنگام بالا رفتن دما موم ذوب ميشود و مواد جامد موجود در لايه رويي موم با مواد پايين مخلوط ميشوند تا PCRآغاز شود و موم به روي فاز آبي قرار ميگيردلايه موم هم يك سددر برابرتبخيرآب درحين چرخه هاي دمايي است وهم بصورت يك مانع فيزيكي،براي جلوگيري از آلودگي عمل ميكند.
RT-PCR:
الگوي اوليه دراين روش مولكول RNA تك زنجيره اي است.ازآنجائيكه DNA پليمراز قادربه استفاده ازRNAبعنوان الگو نميباشد،مرحله ديگري به PCR اضافه شده است.طي اين مرحله با استفاده از آنزيم RT(Reverse Transcriptase) از الگويRNA ،مكملش يعني cDNA سنتز ميشودوسپس بوسيله تكنيك PCRتكثير مي يابدآنزيم نسخه بردار معكوس دراين روش ازويروس ميلوبلاستوماي مرغ (AMV) بدست مي آيد.كاربرد اين آنزيم به دليل حساس بودنش به حرارت پايين بوده ولي با كشف باكتري به نام ترموس ترموفيلوس اين روش بهبود يافت.اين باكتري DNA پليمراز مقاوم به حرارت به نام Tthتوليد مي كندو در حضور يون منگنز داراي فعاليت نسخه برداري معكوس است و در دماي°C72 توسط اين آنزيم از روي RNA، DNA ساخته ميشود.سپس منگنز اضافي توسط اتيلن گليكول تترااستيك اسيد EGTA حذف ميشودواين آنزيم ازDNA اي كه خود ساخته استفاده و آن را تكثير مي كند.براي تكثير ماده ژنتيكي ويروس هاي RNAدار مثل HIV از اين روش استفاده ميشود.
هدف از بكارگيري اين روش توليد DNAتك رشته اي است.در اين روش يكي از پرايمرها به تعداد كمتر و پرايمر ديگر به تعداد بيشتر به محيط واكنش اضافه مي شودتا جائيكه اين نسبت 1:50 يا 1:100 برسد.در حدود 20 چرخه ابتداييPCR محصول دو رشته اي به صورت فاز نمايي توليد مي گردداما پس از 20 چرخه كه غلظت پرايمر كمتر در واكنش قابل چشم پوشي است وبه عبارت عاميانه تر به دليل تمام شدن پرايمر با غلظت كمتر در چرخه هاي بعدي PCR فقط يك رشته از الگو به صورت خطي تكثير مي شود.پس از پايان PCRچند نسخه DNA دو رشته اي و تعداد زيادي DNA تك رشته اي از ژن مورد نظر ايجاد خواهد شد.
ARMS PCR)Amplification Refractory Mutation System):
اين روش تحت عنوان تكثير اختصاصي اللها با PCR نيز ناميده ميشود.اين روش براي تشخيص موتاسيون هاي نقطه اي به كار مي رودوجهت تشخيص اللهاي طبيعي و جهش يافته طراحي شده است.اين روش بر پايه تفاوت نوكلئوتيد انتهاي 3َ پرايمرهايي است كه براي اللهاي مختلف طراحي شده استدو واكنش PCR با استفاده از يك DNA الگودر2 لوله جداگانه انجام مي شود كه يكي از آنها حاوي پرايمرهاي جهش يافته و ديگري حاوي پرايمر طبيعي مي باشددر هرواكنش پرايمر مشترك به همراه يكي از 2 پرايمراختصاصي الل مورد استفاده قرارميگيرد.حالت اختصاصي پرايمرهابراي هريك ازاللها ناشي از نوكلئوتيد انتهاي 3َ آنهاست كه با هم متفاوت بوده.چنانچه پليمريزاسيون در لوله حاوي پرايمر طبيعي انجام شود نشان دهنده نبود جهش نقطه اي در باز مورد نظراست واگر پليمريزاسيون در لوله حاوي پرايمر جهش يافته انجام شود نشان دهنده حضور جهش نقطه اي در باز مورد نظر است.نكته مهم اين است كه از DNAپليمرازي كه فاقد خاصيت تصحيح كنندگي اگزونوكلئازي َ5َ à 3َ است،استفاده شودزيرا استفاده از يك آنزيم اصلاحگر باعث برداشتن باز جفت نشده انتهاي 3َ ميگردد و در واقع توانايي متمايز كردن دو الل از بين ميرود. از اين روش در تشخيص موتاسيون هاي مولد مقاومت دارويي در باكتري ها استفاده مي شود.
Hot-Start PCR:
زمانيكه بهترين شرايط اتصال فراهم شود باندهاي غير اختصاصي ممكن است قبل از انجام اولين چرخه PCR ايجاد شودحتي تاوقتيكه دماي لوله ها تا°C70-°C65 افزايش مي يابد اتصالات غير اختصاصي پرايمر/پرايمر و پرايمر/ الگوممكن است بوجود آيد و بعنوان سوبستراي اوليه براي DNAپليمراز عمل كند.ساده ترين روش براي جلوگيري ازچنين اتصالات اوليه غيراختصاصي وبهتركردن شرايط اتصال صحيح پرايمر،استفاده از روش Hot start است كه اساس اين روش بر جدا كردن فيزيكي مواد واكنش تا زمان رسيدن به دماي بالا مي باشد.يك يا چندماده قبل از رسيدن به دماي بالاتر از °C70 از واكنش جدا مي شود و پس از رسيدن به دماي بالا در واكنش وارد مي كنند.ارزان ترين روش اضافه كردن تمامي مواد واكنش به جز DNA پليمراز است.اين روش براي تعداد زياد نمونه ها به دلايل زيرامكان پذير نيست:1-زمان مورد نياز براي اضافه كردن آنزيم به هرلوله زياد است.2-اشتباه هاي ناشي از عدم تمركز حواس كه باعث اضافه نكردن آنزيم به يك يا چند لوله ميشود .3 -احتمال آلودگي لوله ها به دليل باز شدن در آنها. براي حل اين مشكل وتسهيل انجام PCRگرم آغاز يك سري محصولات تجاري عرضه شده است.مثل Ampliwax Gemsكه گلوله هاي مومي با فرمول خاص ميباشند. يك عدداز آن را در لوله هاي حاوي پرايمر،dNTPs(دئوكسي نوكلئوتيد تري فسفات)،Mg++ اضافه كرده و واكنش در يك ترموسايكلر در دماي °C80-°C75 به مدت 10-5 دقيقه نگهداري ميشود تا موم ذوب شود سپس لوله ها تا زير°C35 سرد ميشودتا موم مجددا جامد شودو يك لايه محافظ بر روي مواداوليه واكنش تشكيل شود.موادديگر واكنش از قبيل DNAالگو،DNAپليمراز و بافر را ميتوان بر روي لايه موم ريخت و سپس PCR را آغاز كرد.در هنگام بالا رفتن دما موم ذوب ميشود و مواد جامد موجود در لايه رويي موم با مواد پايين مخلوط ميشوند تا PCRآغاز شود و موم به روي فاز آبي قرار ميگيردلايه موم هم يك سددر برابرتبخيرآب درحين چرخه هاي دمايي است وهم بصورت يك مانع فيزيكي،براي جلوگيري از آلودگي عمل ميكند.
RT-PCR:
الگوي اوليه دراين روش مولكول RNA تك زنجيره اي است.ازآنجائيكه DNA پليمراز قادربه استفاده ازRNAبعنوان الگو نميباشد،مرحله ديگري به PCR اضافه شده است.طي اين مرحله با استفاده از آنزيم RT(Reverse Transcriptase) از الگويRNA ،مكملش يعني cDNA سنتز ميشودوسپس بوسيله تكنيك PCRتكثير مي يابدآنزيم نسخه بردار معكوس دراين روش ازويروس ميلوبلاستوماي مرغ (AMV) بدست مي آيد.كاربرد اين آنزيم به دليل حساس بودنش به حرارت پايين بوده ولي با كشف باكتري به نام ترموس ترموفيلوس اين روش بهبود يافت.اين باكتري DNA پليمراز مقاوم به حرارت به نام Tthتوليد مي كندو در حضور يون منگنز داراي فعاليت نسخه برداري معكوس است و در دماي°C72 توسط اين آنزيم از روي RNA، DNA ساخته ميشود.سپس منگنز اضافي توسط اتيلن گليكول تترااستيك اسيد EGTA حذف ميشودواين آنزيم ازDNA اي كه خود ساخته استفاده و آن را تكثير مي كند.براي تكثير ماده ژنتيكي ويروس هاي RNAدار مثل HIV از اين روش استفاده ميشود.