Faridma8
New member
مقدمه :
اساس اندازه گيري پروتئين در ادرار به صورت كمي و نيمه كمي و كيفي بر پايه روشهاي ايمونوشيمي، كدورت سنجي و شيميايي با استفاده از نوارهاي تشخيصي مي باشد. در اين ميان روش كدورت سنجي به علت ساده و مقرون به صرفه بودن در آزمايشگاهها كاربرد بيشتري دارد. با توجه به تحقيقات انجام شده در آزمايشگاه رفرانس (۲) روش TCA با استفاده از طول موج ۴۰۵ نانومتر براي سنجش مقادير كم پروتئين بعنوان روش انتخابي معرفي مي شود. نكات مورد توجه در معرفي روش پيشنهادي عبارتند از :
كيفيت قابل قبول نتايج آزمايش
توجه به روشهاي رايج اندازه گيري
سهولت دسترسي به مواد و ابزار مورد نياز
امکانات بيمار در ارتباط با تقبل هزينه هاي آزمايش
ضمناً در بررسي روشها، عوامل كيفي شامل صحت، دقت، محدوده اندازه گيري، خطي بودن و يكنواختي نتايج در استفاده از كاليبراتورهاي متفاوت تعيين گرديده و سپس روش اصلح انتخاب شده است.
اساس آزمايش
در اين روش پروتئين ادرار توسط تري كلرواستيك اسيد ۱۲.۵% رسوب داده مي شود. كدورت ايجاد شده متناسب با مقدار پروتئين (آلبومين و گلبولين) موجود در ادرار است. غلظت پروتئين رسوب داده شده با در نظر گرفتن غلظت اسيد، دما و زمان سپري شدن بين اضافه كردن اسيد تا ايجاد رسوب پروتئين محاسبه مي گردد.
جمع آوري نمونه
در اين آزمايش مي توان از ادرار بصورت انتخابي (Random) استفاده كرد ولي ادرار ۱۲ يا ۲۴ ساعته ترجيح داده مي شود. البته نمونه ادرار ۱۲ يا ۲۴ ساعته بايد بدون افزودن ماده نگهدارنده جمع آوري شده و در تمام مدت نمونه گيري، ظرف حاوي نمونه در محل خنك نگهداري شود. براي جمع آوري بايد از ظرف تميز و عاري از آلودگي استفاده نمود و به بيمار آموزش داده شود كه براي جمع آوري ادرار ۲۴ ساعته، از ساعت ۸ صبح تا ۸ صبح روز بعد تمامي نمونه هاي پس از ساعت ۸ بطور كامل جمع آوري شده ولي ادرار ساعت ۸ صبح روز اول جمع آوري نگردد. بايد توجه نمود كه اگر اندازه گيري پروتئين ادرار در مدت ۴۸ ساعت پس از نمونه گيري انجام نمي شود، مي توان نمونه را خوب مخلوط كرده و پس از تعيين حجم نمونه، بخشي از آن را تا روز انجام آزمايش در فريزر نگهداري نمود.
طرز تهيه TCA ۱۰۰% ذخيره :
توجه: به علت حالت خورندگي TCA بايد تهيه محلول با احتياط و با محافظت از چشمها و دستها انجام گيرد و پس از پايان كار ظروف مورد استفاده كاملاً شسته شوند.
۱۷۵ml آب مقطر ديونيزه شده را به يك ظرف حاوي ۵۰۰g از TCA اضافه مي كنيم. درب ظرف را بسته و به آرامي تكان مي دهيم تا كاملاً حل شود. سپس تمام مواد را به طور كامل به يك بالن ۵۰۰ml حجمي منتقل مي كنيم و حجم كل را به ۵۰۰ml مي رسانيم. براي انحلال كامل طي مدت ۲۴ ساعت، محلول راگهگاه با عمل چرخش مخلوط مي نمائيم.
محلول TCA ۱۰۰% را در يك ظرف تيره و در دماي اتاق نگهداري مي كنيم. اين محلول براي ۱۲ ماه پايدار است.
طرز تهيه (۷۶۵ mmol/l) TCA ۱۲.۵%
با استفاده از پيپت حجمي ۲۵ ميلي متري، مقدار ۲۵ml از محلول TCA۱۰۰% را به بالن ژوژه۲۰۰ ميلي ليتري منتقل مي نماييم و با استفاده از آب مقطر حجم آن را به ۲۰۰ml مي رسانيم. محلول حاصله را كاملاً مخلوط كرده و در ظرف شيشه اي تيره در دماي اتاق نگهداري مي نماييم. اين محلول در دماي اتاق به مدت يك ماه پايدار است.
كنترل :
از سرم كنترلهاي تجاري به عنوان كنترل استفاده مي گردد (رقتي برابر۱/۳۰۰ با استفاده از سرم فيزيولوژي تهيه مي شود).
استاندارد :
براي آزمايشهاي روتين (روزانه) از سرم كنترلهايي ترجيحاً با ارزش مرجع مانند precipath و Bioradو precinorm مشابه استفاده مي شود. براي انجام كار ابتدا غلظت پروتئين اين سرم كنترلها را به مقداري كه امكان وجود آن در ادرار است مي رسانيم. (براي رقيق كردن از سرم فيزيولوژي استفاده ميشود)
لاز به ذكر است ك اين روش تا ۵۰۰mg/L خطي ميباشد، بنابراين نمونه ها اعم از ادرار و استاندارد بايد طوري رقيق شود كه غلظت پروتئين موجود در آنها حداكثر ۵۰۰mg/L باشد.
توجه: از يك نوع نمونه كنترل نمي توان همزمان بعنوان كنترل و استاندارد استفاده نمود.
روش كار
۱ - ۱۰ ml از ادرار مورد آزمايش را سانتريفوژ نموده سپس با استفاده از نوار ادراري پروتئين آن را بررسي مي كنيم و نتيجه را ثبت مي نماييم. اگر غلظت پروتئين بيش از ۱+ بود نمونه ادرار را قبل از شروع آزمايش با سرم فيزيولوژي رقيق ميكنيم. (نمونه هاي ۱+ تقريباً به نسبت ۱/۵۰ و نمونه هاي ۲+ تقريباً ۱/۱۰ و نمونه هاي ۳+ تقريباً ۱/۱۵ رقيق مي شوند). اگر نيتريت ادرار مثبت باشد، مي بايد بيمار را براي نمونه گيري مجدد با رعايت شرايط نمونه گيري راهنمايي نموده و در صورت تكرار آلودگي نمونه، بيمار جهت مشاوره و لزوم بررسي نتايج كامل ادرار و احتمالاً درخواست كشت به پزشك معرفي گردد.
۲ - براي هر آزمايش (نمونه، كنترل و استاندارد) دو لوله در نظر مي گيريم (يكي به عنوان بلانك و ديگري به عنوان آزمايش)
۳ - ۱.۶ml از نمونه ادرار، استاندارد و كنترل را در لوله هاي مربوطه ريخته و سپس ۰.۴ml از محلول TCA۱۲.۵% به همه لوله ها اضافه مي نماييم. به آرامي لوله ها را مخلوط كرده (بهتر است سرلوله ها را با پارافيلم مسدود نموده و با واژگون كردن لوله ها آنها را مخلوط نماييم).
دما در اين مرحله مؤثر بوده و مي بايد بين ۲۳ تا ۲۷ درجه سانتي گراد باشد.
لوله هاي بلانك را بعد از مدت ۲۰ دقيقه به مدت ۱۰ دقيقه با دور ۱۵۰۰ سانتريفوژ مينماييم.
لوله هاي آزمايش را بعد از ۳۵ دقيقه كاملاً مخلوط نموده و جذب نوري آنها را در طول موج ۴۰۵ يا ۴۵۰nm در مقابل مايع رويي بلانك مربوطه بدست مي آوريم.
رعايت زمان ۳۵ دقيقه براي اين آزمايش ضروري مي باشد.
محاسبه :
mg/۲۴h پروتئين = ضريب رقت نمونه * حجم ادرار ۲۴ ساعته (ميلي ليتر) * F * جذب نوري آزمايش
= فاكتور(F) ارزش استاندارد
-----------------------
OD استاندارد
دامنه مرجع
با توجه به توانائي اين روش براي سنجش مقادير كم پروتئين (حدود ۲۵ ميلي گرم در ليتر پروتئين و بيشتر)، از اين روش مي توان براي غربالگري وضعيت كليوي جمعيتهاي مستعد به بيماري كليوي مانند مبتلايان به ديابت در راستاي بررسي ميكروپروتئينوري استفاده نمود.
در افراد سالم مقدار دفع پروتئين تام تا ۱۵۰mg/L در ادرار طبيعي مي باشد.
نكات قابل توجه :
* كدورت حاصله از اضافه شدن TCA به ادرار به دليل وجود آلبومين و گلبولين مي باشد.
* هر نمونه بايد در مقابل بلانك مربوط به خود اندازه گيري شود.
PH* قليايي و پيگمانهاي ادرار باعث ايجاد نتايج مثبت كاذب مي شود.
* دفع پروتئين در ادرار به طور دائم ثابت و مشخص نمي باشد و در دوره هاي۲۴ ساعته تغيير قابل ملاحظه اي دارد. بنابراين براي اندازه گيري پروتئين دفع شده بهتر است از ادرار ۲۴ ساعته استفاده نمود.
* ممكن است بين نتايج بدست آمده از روش كدورت سنجي TCA و بررسي ادرار توسط نوارهاي ادراري تفاوت وجود داشته باشد. مشاهده نتايج منفي يا مقادير كمي پروتئين با نوار ادراري و نتيجه مثبت با روش TCA به طور همزمان ممكن است به دلايل زير باشد :
وجود پروتئين Myeloma (گاما گلبولين و پروتئين بنس جونز) در ادرار.
نمونه هاي غير هموژن به علت استفده از داروهاي خاص مانند Tolmetin و داروهاي ضدالتهاب كه در درمان آرتريت روماتوئيد استفاده مي شود. متابوليتهاي اين داروها مي تواند باعث ايجاد نتايج مثبت كاذب شود.
اساس اندازه گيري پروتئين در ادرار به صورت كمي و نيمه كمي و كيفي بر پايه روشهاي ايمونوشيمي، كدورت سنجي و شيميايي با استفاده از نوارهاي تشخيصي مي باشد. در اين ميان روش كدورت سنجي به علت ساده و مقرون به صرفه بودن در آزمايشگاهها كاربرد بيشتري دارد. با توجه به تحقيقات انجام شده در آزمايشگاه رفرانس (۲) روش TCA با استفاده از طول موج ۴۰۵ نانومتر براي سنجش مقادير كم پروتئين بعنوان روش انتخابي معرفي مي شود. نكات مورد توجه در معرفي روش پيشنهادي عبارتند از :
كيفيت قابل قبول نتايج آزمايش
توجه به روشهاي رايج اندازه گيري
سهولت دسترسي به مواد و ابزار مورد نياز
امکانات بيمار در ارتباط با تقبل هزينه هاي آزمايش
ضمناً در بررسي روشها، عوامل كيفي شامل صحت، دقت، محدوده اندازه گيري، خطي بودن و يكنواختي نتايج در استفاده از كاليبراتورهاي متفاوت تعيين گرديده و سپس روش اصلح انتخاب شده است.
اساس آزمايش
در اين روش پروتئين ادرار توسط تري كلرواستيك اسيد ۱۲.۵% رسوب داده مي شود. كدورت ايجاد شده متناسب با مقدار پروتئين (آلبومين و گلبولين) موجود در ادرار است. غلظت پروتئين رسوب داده شده با در نظر گرفتن غلظت اسيد، دما و زمان سپري شدن بين اضافه كردن اسيد تا ايجاد رسوب پروتئين محاسبه مي گردد.
جمع آوري نمونه
در اين آزمايش مي توان از ادرار بصورت انتخابي (Random) استفاده كرد ولي ادرار ۱۲ يا ۲۴ ساعته ترجيح داده مي شود. البته نمونه ادرار ۱۲ يا ۲۴ ساعته بايد بدون افزودن ماده نگهدارنده جمع آوري شده و در تمام مدت نمونه گيري، ظرف حاوي نمونه در محل خنك نگهداري شود. براي جمع آوري بايد از ظرف تميز و عاري از آلودگي استفاده نمود و به بيمار آموزش داده شود كه براي جمع آوري ادرار ۲۴ ساعته، از ساعت ۸ صبح تا ۸ صبح روز بعد تمامي نمونه هاي پس از ساعت ۸ بطور كامل جمع آوري شده ولي ادرار ساعت ۸ صبح روز اول جمع آوري نگردد. بايد توجه نمود كه اگر اندازه گيري پروتئين ادرار در مدت ۴۸ ساعت پس از نمونه گيري انجام نمي شود، مي توان نمونه را خوب مخلوط كرده و پس از تعيين حجم نمونه، بخشي از آن را تا روز انجام آزمايش در فريزر نگهداري نمود.
طرز تهيه TCA ۱۰۰% ذخيره :
توجه: به علت حالت خورندگي TCA بايد تهيه محلول با احتياط و با محافظت از چشمها و دستها انجام گيرد و پس از پايان كار ظروف مورد استفاده كاملاً شسته شوند.
۱۷۵ml آب مقطر ديونيزه شده را به يك ظرف حاوي ۵۰۰g از TCA اضافه مي كنيم. درب ظرف را بسته و به آرامي تكان مي دهيم تا كاملاً حل شود. سپس تمام مواد را به طور كامل به يك بالن ۵۰۰ml حجمي منتقل مي كنيم و حجم كل را به ۵۰۰ml مي رسانيم. براي انحلال كامل طي مدت ۲۴ ساعت، محلول راگهگاه با عمل چرخش مخلوط مي نمائيم.
محلول TCA ۱۰۰% را در يك ظرف تيره و در دماي اتاق نگهداري مي كنيم. اين محلول براي ۱۲ ماه پايدار است.
طرز تهيه (۷۶۵ mmol/l) TCA ۱۲.۵%
با استفاده از پيپت حجمي ۲۵ ميلي متري، مقدار ۲۵ml از محلول TCA۱۰۰% را به بالن ژوژه۲۰۰ ميلي ليتري منتقل مي نماييم و با استفاده از آب مقطر حجم آن را به ۲۰۰ml مي رسانيم. محلول حاصله را كاملاً مخلوط كرده و در ظرف شيشه اي تيره در دماي اتاق نگهداري مي نماييم. اين محلول در دماي اتاق به مدت يك ماه پايدار است.
كنترل :
از سرم كنترلهاي تجاري به عنوان كنترل استفاده مي گردد (رقتي برابر۱/۳۰۰ با استفاده از سرم فيزيولوژي تهيه مي شود).
استاندارد :
براي آزمايشهاي روتين (روزانه) از سرم كنترلهايي ترجيحاً با ارزش مرجع مانند precipath و Bioradو precinorm مشابه استفاده مي شود. براي انجام كار ابتدا غلظت پروتئين اين سرم كنترلها را به مقداري كه امكان وجود آن در ادرار است مي رسانيم. (براي رقيق كردن از سرم فيزيولوژي استفاده ميشود)
لاز به ذكر است ك اين روش تا ۵۰۰mg/L خطي ميباشد، بنابراين نمونه ها اعم از ادرار و استاندارد بايد طوري رقيق شود كه غلظت پروتئين موجود در آنها حداكثر ۵۰۰mg/L باشد.
توجه: از يك نوع نمونه كنترل نمي توان همزمان بعنوان كنترل و استاندارد استفاده نمود.
روش كار
۱ - ۱۰ ml از ادرار مورد آزمايش را سانتريفوژ نموده سپس با استفاده از نوار ادراري پروتئين آن را بررسي مي كنيم و نتيجه را ثبت مي نماييم. اگر غلظت پروتئين بيش از ۱+ بود نمونه ادرار را قبل از شروع آزمايش با سرم فيزيولوژي رقيق ميكنيم. (نمونه هاي ۱+ تقريباً به نسبت ۱/۵۰ و نمونه هاي ۲+ تقريباً ۱/۱۰ و نمونه هاي ۳+ تقريباً ۱/۱۵ رقيق مي شوند). اگر نيتريت ادرار مثبت باشد، مي بايد بيمار را براي نمونه گيري مجدد با رعايت شرايط نمونه گيري راهنمايي نموده و در صورت تكرار آلودگي نمونه، بيمار جهت مشاوره و لزوم بررسي نتايج كامل ادرار و احتمالاً درخواست كشت به پزشك معرفي گردد.
۲ - براي هر آزمايش (نمونه، كنترل و استاندارد) دو لوله در نظر مي گيريم (يكي به عنوان بلانك و ديگري به عنوان آزمايش)
۳ - ۱.۶ml از نمونه ادرار، استاندارد و كنترل را در لوله هاي مربوطه ريخته و سپس ۰.۴ml از محلول TCA۱۲.۵% به همه لوله ها اضافه مي نماييم. به آرامي لوله ها را مخلوط كرده (بهتر است سرلوله ها را با پارافيلم مسدود نموده و با واژگون كردن لوله ها آنها را مخلوط نماييم).
دما در اين مرحله مؤثر بوده و مي بايد بين ۲۳ تا ۲۷ درجه سانتي گراد باشد.
لوله هاي بلانك را بعد از مدت ۲۰ دقيقه به مدت ۱۰ دقيقه با دور ۱۵۰۰ سانتريفوژ مينماييم.
لوله هاي آزمايش را بعد از ۳۵ دقيقه كاملاً مخلوط نموده و جذب نوري آنها را در طول موج ۴۰۵ يا ۴۵۰nm در مقابل مايع رويي بلانك مربوطه بدست مي آوريم.
رعايت زمان ۳۵ دقيقه براي اين آزمايش ضروري مي باشد.
محاسبه :
mg/۲۴h پروتئين = ضريب رقت نمونه * حجم ادرار ۲۴ ساعته (ميلي ليتر) * F * جذب نوري آزمايش
= فاكتور(F) ارزش استاندارد
-----------------------
OD استاندارد
دامنه مرجع
با توجه به توانائي اين روش براي سنجش مقادير كم پروتئين (حدود ۲۵ ميلي گرم در ليتر پروتئين و بيشتر)، از اين روش مي توان براي غربالگري وضعيت كليوي جمعيتهاي مستعد به بيماري كليوي مانند مبتلايان به ديابت در راستاي بررسي ميكروپروتئينوري استفاده نمود.
در افراد سالم مقدار دفع پروتئين تام تا ۱۵۰mg/L در ادرار طبيعي مي باشد.
نكات قابل توجه :
* كدورت حاصله از اضافه شدن TCA به ادرار به دليل وجود آلبومين و گلبولين مي باشد.
* هر نمونه بايد در مقابل بلانك مربوط به خود اندازه گيري شود.
PH* قليايي و پيگمانهاي ادرار باعث ايجاد نتايج مثبت كاذب مي شود.
* دفع پروتئين در ادرار به طور دائم ثابت و مشخص نمي باشد و در دوره هاي۲۴ ساعته تغيير قابل ملاحظه اي دارد. بنابراين براي اندازه گيري پروتئين دفع شده بهتر است از ادرار ۲۴ ساعته استفاده نمود.
* ممكن است بين نتايج بدست آمده از روش كدورت سنجي TCA و بررسي ادرار توسط نوارهاي ادراري تفاوت وجود داشته باشد. مشاهده نتايج منفي يا مقادير كمي پروتئين با نوار ادراري و نتيجه مثبت با روش TCA به طور همزمان ممكن است به دلايل زير باشد :
وجود پروتئين Myeloma (گاما گلبولين و پروتئين بنس جونز) در ادرار.
نمونه هاي غير هموژن به علت استفده از داروهاي خاص مانند Tolmetin و داروهاي ضدالتهاب كه در درمان آرتريت روماتوئيد استفاده مي شود. متابوليتهاي اين داروها مي تواند باعث ايجاد نتايج مثبت كاذب شود.
