استخراج dna

Farzan

New member
روش های استخراج dna از نمونه های مختلف و استخراج dna کروموزومی و پلاسمیدی...؟
 

marava

New member
دستورالعمل استخراج DNA با پشتوانه ای از دانش بیوشیمی همراه است و نباید صرفاً استفاده از چند ماده انگاشته شود . درک عملکرد هر ماده این امکان را فراهم خواهد نمود که در صورت نبود یک ماده ، از ماده دیگری با کار مشابه استفاده کرد .
روشهای مختلفی برای تخلیص DNA وجود دارد که در اینجا به چند روش برای تخلیص DNA از خون و نمونه های بافتی می پردازیم .
1 – تخلیص DNA از خون :
بــرای تخلیـص DNA از گلبولهای سفید خون استفاده می شود . برای این کار چندین روش از جمله روش فنل – کلروفرم ، روش پروتئیناز K ، روش جوشاندن ، روش اسید – گوانیدیوم – فنل – کلروفرم ( AGPC ) و … استفاده می شود که در اینجا دو روش پروتئیناز K و روش جوشاندن به علت کم هزینه بودن آنها شرح داده می شود .
( 1 – 1 ) روش جوشاندن :
مواد مورد نیاز :
1 – بافر لیز کننده گلبولهای قرمز ( بافر R ) : که شامل مواد زیر می باشد :
- باز تریس با PH = 7/5 10 میلی مولار
- ساکارز 32% مولار
- کلرید منیزیم ( MgCl 2 ) 10 میلی مولار یا 5 میلی مولار
- تریتون 100X 1%
مخلوط کرده و حجم را با آب مقطر به 50 میلی لیتر می رسانیم .
2 – محلول ( I ) : هیدروکسید سدیم ( NaOH ) 50 میلی مولار
3 – محلول ( II ) . باز تریس یک مولار
روش کار:
نیـم میلی لیتر خون فاقد هپارین را در میکروتیوب ریخته و به آن یک میلی لیتر بافر R اضافه می کنیم و خوب مخلوط می کنیم . سپس به مدت دو دقیقه با شدت 1000 دور در دقیقه آنرا سانتریفوژ می کنیم . بعد محلول رویی که حاوی گلبولهای قرمز لیزشده و پلاسمای خون می باشد را دور ریخته و مجدداً حدود 200 میکرو لیتر بافر R به میکروتیوب اضافه کرده و هم می زنیم تا رسوب موجود در میکروتیوب به رنگ سفید در آید و مجدداً با شدت1000دور در دقیقه سانتریفوژ می کنیم . این عمل را تا تهیه رسوب کاملاً سفید ادامه می دهیم . در مرحله بعد 100 میکرولیتر محلول(I) بر روی رسوب ریخته و آنقدر هم می زنیم تا رسوب حل شود . سپس میکرو تیوبها را به مدت 20 دقیقــه در آب جــوش قــرار داده تا گلبولهای سفید لیز شوند . در آخرین مرحله 20 میکـرولـیتر محـلول (II) را بـه میکروتیوپ اضافه می کنیــم . ( ایــن محلول باعث نگهداری و حفاظت DNA در محلول می شود) و هم می زنیم و سپس به مدت 30-20 ثانیه با دور 1000 سانتریفوژ می کنیم و در نهایت محلول رویی که حاوی DNA می باشد با احتیاط به یک میکروتیوپ جدید منتقل می کنیم . سپس با اتانل مطلق DNA را رسوب می دهیم.
بحث :
روش جوشاندن دارای معایب و محاسن متعددی است . این روش اصولاً دارای مرحله ای تحت عنوان خالص سازی نمی باشد ، بلکه توانایی آن تنها از این نظر مهم میباشد که میتواند DNA را در دسترس قرار دهد . علاوه بر این مواد مصرفی در این روش کمتر بوده و در زمان کوتاه امکان کار با نمونه های انبوه وجود داشته و آلودگی در آزمایشگاه نیز کمتر خواهد بود . از معایب این روش هم عدم حذف کامل مهار کننده ها می باشد و دیگر اینکه روش جوشاندن قادر به استفاده نمونه های با مقادیر کم DNA نمی باشد . با وجود معایب متعدد آن بواسطه سرعت مطلوب این روش در بسیاری از آزمایشگاههای تشخیص طبی که از PCR استفاده می گردد برای آماده نمودن DNA از آن استفاده می نمایند . با استفاده ازاین روش می توان به آسانی از خون تازه ، لخته شده ، کهنه و خشک و همچنین عوامل بیماریزا DNA را استخراج کرد.

برگرفته از لینک زیر:
روشهای آزمایشگاهی استخراج DNA
 

marava

New member
روش پروتئیناز K :
مواد مورد نیاز :
1 – بافر لیزکننده گلبولهای قرمز ( بافر R )
2 – بافرP که شامل مواد زیر می باشد :
- اتیلن دی آمین تترااستیک اسید ( EDTA ) با 2/8 = PH 2 میلی مولار
- باز تریس 10 میلی مولار
- کلرید سدیم ( NaCl ) 44% مولار
3 – محلول S : سدیم دودسیل سولفات ( SDS ) 10%
4 – محلول N : کلرید سدیم ( NaCl ) 4 مولار
5 – محلول TE که شامل مواد زیر می باشد :
- EDTA با 8 = PH 1 میلی مولار
- باز تریس با 6/7 = PH 10 میلی مولار
6 – پروتئیناز K : از این آنزیم با غلظت 20 میلی گرم در میلی لیتر ( mg/ml 20 ) استفاده می شود که پروتئینهای هیستونی و غیر هیستونی در DNA را تخریب می کند . این آنزیم در دمای 55 درجه سانتی گراد بهترین فعالیت را دارا می باشد .
7 – اتانل مطلق و اتانل 70 درصد
روش کار :
نیــم میلی لیتر خون را در یک میکروتیوب ریخته و برای لیز کردن گلبولهای قرمز به آن به میزان یک میلی لیتر بافر R اضافه می کنیم خوب مخلوط کرده و با دور xg 1000 به مدت 2 دقیقه سانتریفوژ انجام می گردد . پس از سانتریفوژ ، محلول رویی که حاوی گلبولهای قرمز لیز شده و پلاسمای خون می باشد را دور ریخته و مجدداً حدود 500-200 میکرولیتر بافر R به میکروتیوب اضافه می کنیم و بعد سانتریفوژ انجام می گیرد . این کار را تا به دست آوردن رسوب سفیــد رنگ در میکروتیــوب ادامــه می دهیــم . پس از تهیه رسوب سفید ، 300 میکرولیتر بافر P به منظور لیز کردن گلبــولهای سفید به مبکروتیوب اضافه می کنیم و پس از هم زدن ، به میزان 20 میکرولیتر محلول S ( جهت دناتوره کردن پروتئینها ) به میکروتیوب اضافه می کنیم و آنقدر هم می زنیم تا رسوب کاملاً حل گردد . بعد به میزان 5 میکرولیتر از آنزیم پروتئیناز K ( mg/ml 20 ) به میکروتیوب اضافه کرده و خوب حل می کنیم . سپس میکروتیوبها در دمای 55 درجه سانتی گراد و به مدت یک ساعت انکوبه می شوند ( در طول شب در دمای 37 درجه نیز قرار داده می شود . ) بایستی هر 5 دقیقه یکبار محتویات میکروتیوب را هم زد . پس از گذشت این زمان ، صد میکرولیتر محلول N به لوله اضافه شده و به طور مختصر هم می زنیم و بعد به مدت 30 – 10 دقیقه در یخ قرار داده تا حالت ابری ( به علت رسوب پروتئینها ) در محلول داخل میکروتیوب مشاهده شود . میکروتیوب را به مدت 10 دقیقه با دور xg 1000 سانتریفوژ می کنیم و محلول شفاف رویی با احتیاط به میکروتیوبهای جدید منتقل می شود . ( رسوب موجود حاوی پروتئینهای دناتوره می باشد . ) به محلول رویی جدا شده یک میلی لیتر اتانول مطلق سرد اضــافه شــده و بــه آرامــی هــم می زنیم . تا کلافهای شیری رنگ DNA مشاهده شود . سپس مدت 10 دقیقه با دور xg 1000 سانتریفوژ نموده و محلول رویی را دور ریخته و بر روی رسوب ( مولکولهای DNA ) باقی مانده صد میکرولیتر اتانل 70 درصد ریخته ( جهت شستشو ) و خوب هم می زنیم و سپس برای مدت 2 دقیقه با دور xg 1000 سانتریفوژ می کنیم . محلول رویی را دور ریخته و میکروتیوبها را به کمک حرارت در زیر هود و درجه حرارت اتانل خشک می کنیم و سپس به هر یک از میکروتیوبها 100 میکرولیتر بافر TE یا آب مقطر بدون یون اضافه کرده و به آرامی به هم زده تا رسوب DNA حل شود . برای حل شدن بهتر DNA می تونا از حرارت 60 درجه ســـانتی گراد حمام بخار آب جوش استفاده می شود.

برگرفته از لینک زیر
روشهای آزمایشگاهی استخراج DNA
 

marava

New member
تخلیص DNA از نمونه بافتی ( کرم ، اسکولکس ، جفت و … ) :
روشهای مختلفی از قبیل آنزیم تریپین ، روش جوشاندن ، روش اسید گوانیدیم فنل کلروفرم ( AGPC ) ، روش TRIzoL و DNAzoL وجود دارد که در اینجا به شرح چند روش می پردازیم :
( 1 – 2 )‌ روش تخلیص DNA از ترایزول ( TRIzoL ) :
این محلول که حاوی فنل و گوانیدین ایزوسیانات می باشد به صورت تجاری موجود می باشد .
مواد مورد نیاز :
1 – ترایزول
2 – اتانل مطلق و اتانل 75 درجه
3 – سود 8/0 مولار
4 – کلروفرم
5 – سیترات سدیم 1/0 مول در اتانل 10 درصد
روش کار :

مرحله ( 1 ) : تهیه پلیت DNA از بافت :

100 – 50 میلی گرم نمونه بافتی ( کرم یا اسکولکس ) را در داخل هموژنیزر یا یک هاون کوچک قرار داده و نمونه را کاملاً خرد می نمائیم ( بهتر است ابتدا با قیچی نمونه به قطعات کوچک تقسیم نمود . )‌ در صورتی که نمونه در هاون ساییده شود مقداری شن استریل روی آن ریخته تا کاملاً سائیده شود . سپس به آن یک میلی لیتر ترایزول اضافه نموده و خوب مخلوط می کنیم و آن را داخل میکروتیوب ریخته و برای مدت 5 دقیقه نمونه هموژنیزه شده را در دمای 30 – 15 درجه سانتی گراد قرار می دهیم تا پروتئینها دناتوره شوند . سپس در آن به هر میکروتیوب 200 میکرولیتر کلروفرم اضـافه نموده وآنها را به شدت برای 15 ثانیه با دست تکان داده و برای مدت 3 – 2 دقیقه در دمای 30 – 15 درجه سانتی گراد قرار می دهیم و سپس با دور xg 12000 برای مدت 15 دقیقه سانتریفوژ می کنیم . ( در صورتی که سانتریفوژ یخچالدار موجود باشد در دمای 8 – 2 درجه سانتی گراد سانتریفوژ انجام می گیرد ) . سپس سه فاز در میکروتیوب در میکروتیوب ایجاد می شود . فاز پایینی قرمز ، فاز وسط حاوی فنل و کلروفرم و فاز بالایی بی رنگ می باشد و حاوی RNA است .تمام فاز بالایی را به دقت خارج کرده و دور می ریزیم . فاز وسط و فاز ارگانیک ( پایین ) را به داخل میکروتیوب جدید ریخته و به آن 300 میکرولیتر اتانل مطلق اضافه می کنیم و با خم و راست کردن دست محتویات داخل میکروتیوب را مخلوط می کنیم . نمونه را به مدت 3 – 2 دقیقه در دمای 30 – 15 درجه سانتی گراد قرار می دهیم تا DNA ته نشین گردد . سپس به مدت 5 دقیقه با دور 2000 سانتریفوژ نمونه تا پلیت DNA در ته میکروتیوب تشکیل گردد بعد مایع رویی را دور ریخته و پلیت DNA در میکروتیوب باقی می ماند .

مرحله ( 2 ) : شستن پلیت DNA :

پلیــت DNA را دو مرتبــه با محلول سیترات سدیم 1/0 مول در اتانل 10% شستشو می دهیم ( هر بار با یک میلی لیتر ) . در هر بار شستشـو پــلیت DNA را بــرای مــدت 30 دقیقه در محلول سیترات سدیم در دمای 30 – 15 درجه سانتی گراد قرار داده و هر چند دقیقه یکبار آن را تکان داده و مخلوط می نمائیم و سپس برای مدت 5 دقیقه با دور XG 2000 سانتریفوژ می نمائیم . مایع رویی را دور ریخته و به آن 2 – 5/1 میلی لیتر اتانل 75درجه به پلیت DNA اضافه نموده و برای 20 – 10 دقیقه در دمای 30 – 15 درجه سانتی گراد قرار می دهیم و سپس برای مدت 5 دقیقه مجدداً با دور XG 2000 سانتریفوژ می کنیم و بعد مایع رویی را خارج کرده و پلیت DNA در لوله باقی می ماند .

مرحله ( 3 ) : حل کردن DNA :

پلیت DNA را برای مدت 10 – 5 دقیقه در زیر هود یا در خلاء خشک نموده و سپس به ازای هر 70 – 50 گرم نمــونه بــافتــی ، 600-300 میلی لیتر سود 8میلی مولار به DNAی جدا شده اضافه می کنیم . ( محلول بازی می تواند ثبات DNA را حفظ کند . ) ممکن است پس از حل کردن DNA در سود موادهای غیرقابل حل ژلاتین به وجود آیــد که آن را با سانتریفوژ کــردن بـــا دور xg 12000 برای مدت 10 دقیقه رسوب داده و مایع رویی ( DNA ) را به یک میکروتیوب جدید منتقل می کنیم و برای انجام PCR از آن استفاده می کنیم .

برگرفته از لینک زیر:
روشهای آزمایشگاهی استخراج DNA
 

marava

New member
بعد از تخلیص DNA با استفاده از روشهای مختلف باید غلظت DNA بدست آمده را تعیین کرد. برای این منظور از دو روش استفاده می شود :1) روش الکتروفورز 2) روش اسپکتوفتومتری
روش الکتروفورز :
در این روش نمونه DNA ی تخلیص شده را همراه با شناساگرهایی ( مارکر ) که غلظت آنها مشخص است الکتروفورز کرده و با مقایسه باندهای ایجاد شده مربوطه به DNA تخلیص شده با باند مارکر می توان به طور کیفی مقدار DNA را مشخص کرد . برای این منظور 5 میکرولیتر از محلول DNA را به همراه یک میکرولیتر بافر بارگیری بــر روی ژل آگار 8/0 درصــد نمونــه گذاری کرده و الکتروفورز می شود . برای دیدن باند DNA بایستی ژل را به مدت 5 دقیقه در محلول اتیدیوم بروماید ( mg/ml 5/0 ) قرار داده و بعد در زیر نور ماوراء بنفش بر روی دستگاه UV-transiliuminator مشاهده کرد ( و یا می توان اتیدیوم بروماید را در زمان تهیه به ژن اضافه کرد . )

برگرفته از لینک زیر:
روشهای آزمایشگاهی استخراج DNA
 
بالا