کارگاه مجازی بیوانفورماتیک
- نویسنده موضوع n.b.m
- تاریخ شروع
mj1919
New member
با سلام
همانطور که در پ خ ، بخشی اش را عرض کردم،
برای پیدا کردن یک توالی مناسب برای دیتکشن(detection) یک ارگانیسم باید یک توالی منحصر به فرد از آن را PCR کنید.
یعنی توالی شما مختص به همان ارگانیسم باشد (تقریبا)، که به عنوان یک مارکر شناسایی همان ارگانیسم در نمونه ی شما استفاده بشه.
برای اینکار شما به ابزارهای NCBI نیاز دارید:
ما چند کار انجام می دیم. من تمام مراحل کار را برای یک ارگانیسم فرضی، مایکوباکتریوم توبر کلوزیس، انجام می دم.
1- پیدا کردن این باکتری در بخش نوکلوتید سایت NCBI
2- بلست کردن (BLAST) این ارگانیسم (بر اساس کد دسترسی ویا توالی فاستا- FASTA)
3- پیدا کردن یک سری توالی های منحصر به فرد از این ارگانیسم بر اساس نتایج بلست
4- پیدا کردن یک تعدا پرایمر های PCR بر اساس توالی های منحصر به فرد بالا
5- چک کردن پرایمرها
از اونجایی که الان توی اروپا و آمریکا روز هست و ترافیک NCBI بالاست ، نتیجه ی بلست بالا نمیاد.... هی قطع میشه... این پاسخ رو فردا تکمیل میکنم....
n.b.m
New member
خیلی ممنونم بخاطر راهنمایی های خوبتون.
خیلی لطف میکنید.چشم منتظر میمونم.
فقط یه سوال کد دسترسی ویا توالی فاستا- FASTA چی هست؟ ببخشید من تازه وارد کار مولکولی شدم زیاد اطلاعی ندارم! :riz513:
این سوالارو زیاد میپرسم از اساتید ولی یا خوب جواب نمیدن یا اینکه میگن از فلان دانشجوی phd بپرس که داره کار میکنه!
اما من دیدم که شما همیشه خیلی خوب و روان توضیح میدن گفتم شما که ژنتیک می خونید بهتره از شما بپرسم
بازم ممنونم
mj1919
New member
ممنون
عجله نکنید!
از تمام مراحل کار عکس میگیرم و به همراه متن توضیح میدم....
فردا انشاالله
n.b.m
New member
mj1919
New member
من هیچ راه دستی رو نمی شناسم، غیر از اینکه همه ی توالی رو پرینت بگیری و با یک ماژیک بیفتی به حونش!
ولی جدا!
gene runner هست که من توصیه نمی کنم،
به نظر من بهترین ابزار همون primer designer و primer BLAST موجود در سایت NCBI است . و نیز primer 3 (که الگوریتم هر دو یکی هست)
و در نهایت جک کردن پرایمر ها با بلست ان سی بی آی
najma
New member
منظورم با مگا 4 هستا ... دقیقا مثل این پرینت و ماژیکه کارش ...
آخه با برنامه ها جواب نمیده اگر خیلی شبیه باشن ...پیدا نمیکنه :sad:
آخرین ویرایش:
mj1919
New member
من با مگا 4 کار نکردم، ولی در مورد ادامه ی فرمایشتون:
در شرایط زیر ؛ بله از لخاظ عملیاتی ، با این پرایمر ها به نظر من میشه PCR کرد:
اگه گپ بین دوتا ایزوفرم (یعنی اندازه ی توالی که یکی از یکی کوچکتره) بزرگ باشه، اونقدی که روی ژل نشون بده، میشه برای PCR استفاده کرد، مثلا 20 bp و بیشتر باشه (البته اندازه ی کوچکتر هم تا حدودی میشه)
اگه با real tim PCR برای دیتکشن استفاده می کنید، اندازه های کوچکتر و بزرگتر به راحتی قابل تشخیص هستند.
mj1919
New member
پیدا کردن توالی ژنوم یک ارگانیسم در سایت NCBI
در اینجا من از مایکوباکتریوم توبرکلوزیس به عنوان مثال استفاده می کنم
برای این کار اسم درست (بدون غلط ) باکتری تون رو در سایت NCBI در بخش نوکلئوتید سرچ کنید.
در بخش bacteria کلیک کنید.
از بین نتایج، سوش مورد نظر خودتون رو پیدا کنید،
کد اکسسشن در زیر هر نمونه را که پیدا کردید یاد داشت کنید، این کد برای بلست نیاز است. این کد ، کد دسترسی به توالی ژنوم این ارگانیسم است.
همه ی موارد های لایت شده
در اینجا من از مایکوباکتریوم توبرکلوزیس به عنوان مثال استفاده می کنم
برای این کار اسم درست (بدون غلط ) باکتری تون رو در سایت NCBI در بخش نوکلئوتید سرچ کنید.
در بخش bacteria کلیک کنید.
از بین نتایج، سوش مورد نظر خودتون رو پیدا کنید،
کد اکسسشن در زیر هر نمونه را که پیدا کردید یاد داشت کنید، این کد برای بلست نیاز است. این کد ، کد دسترسی به توالی ژنوم این ارگانیسم است.
همه ی موارد های لایت شده
mj1919
New member
BLAST primerکردن یک توالی در سایت NCBI
وقتی ارگانیسم تون رو پیدا کردید و
یک توالی یک کیلو بازی (کمتر یا بیشتر) از توالی رو کپی کنید و در پرایمر بلست پست کنید (شاید با کد دسترسی - که در صفحه ی قبل توضیح دادم هم جواب بده ولی بهتر که یک توای کوتاهتر رو بذارید)
مشابه این آدرس برای م. توبرکلوزیس:
Mycobacterium tuberculosis H37Rv complete genome - Nucleotide - NCBI
بعد توالی کپی شده را در نرم افزار پرایمر بلست کپی کنید و ران کنید:
آموزش پرایمر بلست در یو تیوب:
BLAST - PCR Primers Design - YouTube
آموزش دیگر:
Primer-BLAST-New Primer Design Tool-Tutorial ~ Bimatics
آموزش یات ان سی بی آی:
Design PCR primers and check them for specificity
در صورتی که در طی مراحل کار به مشکلی برخوردید همینجا مطرح نمایید.
خواهش میکنم که آموزش ها را ابتدا ببینید و بعد انجام دهید،
موفق باشید(به خاطر دیر شد، عذر میخام)،
وقتی ارگانیسم تون رو پیدا کردید و
یک توالی یک کیلو بازی (کمتر یا بیشتر) از توالی رو کپی کنید و در پرایمر بلست پست کنید (شاید با کد دسترسی - که در صفحه ی قبل توضیح دادم هم جواب بده ولی بهتر که یک توای کوتاهتر رو بذارید)
مشابه این آدرس برای م. توبرکلوزیس:
Mycobacterium tuberculosis H37Rv complete genome - Nucleotide - NCBI
بعد توالی کپی شده را در نرم افزار پرایمر بلست کپی کنید و ران کنید:
آموزش پرایمر بلست در یو تیوب:
BLAST - PCR Primers Design - YouTube
آموزش دیگر:
Primer-BLAST-New Primer Design Tool-Tutorial ~ Bimatics
آموزش یات ان سی بی آی:
Design PCR primers and check them for specificity
در صورتی که در طی مراحل کار به مشکلی برخوردید همینجا مطرح نمایید.
خواهش میکنم که آموزش ها را ابتدا ببینید و بعد انجام دهید،
موفق باشید(به خاطر دیر شد، عذر میخام)،
mj1919
New member
سلام
من یکسری اطلاعات دارم، راجع جهش زایی هدفمند با پی سی آر توی پلاسمید.
خب دنبال چجور اطلاعاتی هستید؟ سوالتون چیه؟
mj1919
New member
مثلا میشه درمورد این یه کوچولوتوضیح بدین؟
اساس این تکنیک همانطوری که توی شکل رسم شده، مبتنی بر پرایمر های میس مچ است.
بدین ترتیب که، شما برای بخشی از پلاسمید پرایمر طراحی می کنید ولی در پرایمر یک باز (یا بیشتر) ، بازی متفاوت با تمپلیت می ذارید.(این تغییر تک بازی باعث تغییر آموینو اسیدی در پروتئین مری گردد)
در این شکل دو تا جهش ایجاد کرده است. هر کدوم با یک پرایمر.
بعد از، یکی دو سیکل از هرکدام از محصولات چند نسخه داریم: محصولات دارای دو جهش و محصولات معمولی بدون جهش.
محصول بدون جهش چون از پلاسمید باکتری (تکثیر شده در باکتری) است پس دارای متیلیشن است به همین خاطر با آنزیم دی پی ان وان بریده شده و تخریب می گردد.
از سوی دیگر، مخصول پی سی آر ما که دارای جهش است، و غیر میتله، بریده نمی شود، پس در ادامه ی پ س ر، تکثیر می گردد.
به همین راحتی.
mj1919
New member
اصول اولیه ی طراحی پرایمر، با روش دستی (نرم افزار Gene runner)
در مورد طراجی پرایمر هم با روش دستی، یکسری اصول داره، که من با نرم افزار جین رانر انجام دادم، و یکسری اصول ابتدایی شو اینجا می گم:
1- طول 20-22 باشه
2-چک کنید، کخه پرایمر ها مکمل هم نباشند،
3- هر پرایمر با خودش تشکیل لوپ نده
4- جی سی پرایمر ها شبیه هم و و نزدیک 50 باشه
5- دمای آنیلینگ پرایمر ها نزدیک اکستنشن (70 برای تک دی ان آ پلیمراز) باشه
6- تی ام دوتا پرایمر از هم بیشتر از 5 درجه اختلاف نداشته باشن (حدالامکان یکی باشه)
7- واسه س پرایمر های دیتکشن (خصوصا ذیل تایم) اندازه های 100-300 تا را تکثیر کنید
اینا یادمه ، در صورتی که مواردی خاطرتون هست، بفرمایید به لیست اضافه کنم...
در مورد طراجی پرایمر هم با روش دستی، یکسری اصول داره، که من با نرم افزار جین رانر انجام دادم، و یکسری اصول ابتدایی شو اینجا می گم:
1- طول 20-22 باشه
2-چک کنید، کخه پرایمر ها مکمل هم نباشند،
3- هر پرایمر با خودش تشکیل لوپ نده
4- جی سی پرایمر ها شبیه هم و و نزدیک 50 باشه
5- دمای آنیلینگ پرایمر ها نزدیک اکستنشن (70 برای تک دی ان آ پلیمراز) باشه
6- تی ام دوتا پرایمر از هم بیشتر از 5 درجه اختلاف نداشته باشن (حدالامکان یکی باشه)
7- واسه س پرایمر های دیتکشن (خصوصا ذیل تایم) اندازه های 100-300 تا را تکثیر کنید
اینا یادمه ، در صورتی که مواردی خاطرتون هست، بفرمایید به لیست اضافه کنم...
mj1919
New member
دمای آنیلینگ بسته به طول پرایمرتون تعیین میشه،
دمای اکستنشن هم که به نوع آنزیم پلیمرازتون بستگی داره (از 60 تا 70 و خورده ای و بیشتر)