الایزا یا elisa

maxin

Well-known member

• 2014-03-20

• #1

ELISA مخفف عبارت Enzyme-Linked Immunosorbent Assay یک روش آزمایشگاهی بیوشیمیایی ساده با حساسیت بسیار بالا است که امکان آنالیز تعداد زیادی نمونه را به صورت همزمان فراهم می کند. این روش در ایمونولوژی (ایمنی شناسی) برای تشخیص وجود یک آنتی بادی یا آنتی ژن در نمونه مورد آزمایش استفاده می شود که عموما به عنوان ابزاری تشخیصی در پزشکی و پاتولوژی و همچنین تست کنترل کیفیت در بسیاری از صنایع کاربرد دارد.


ELISA بر پایه اندازه گیری کمپلکس رنگی آنتیژن و آنتیبادی استوار است. به این ترتیب که نمونه مورد آزمایش با مقدار نامشخصی آنتی ژن روی فاز جامد (معمولا پلیت پلی استیرن) ریخته می شود، سپس آنتی بادی بازیابی اضافه میشود تا با آنتی ژن واکنش داده و ترکیبی ایجاد کند. آنتی بادی بازیابی با آنزیم پیوندی کووالانسی برقرار می کند. بین هر مرحله پلیت با محلول پاک کننده ملایمی شسته می شود تا هر پروتئین یا آنتی بادی باقیمانده شسته شود. پیش از آخرین مرحله شستشو، پلیت با اضافه کردن زیر لایه آنزیمی کشت داده می شود و ماده رنگی تولید میشود. طول موج رنگ به دست آمده توسط یک دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت شده و ثبت میشود که این طول موج معرف حضور یک آنتیبادی یا آنتیژن و نیز غلظت آن است. در ELISA های قدیمی تر زیرلایه رنگزا به کار گرفته میشد در حالیکه در تست های جدیدتر زیرلایه های فلوروژنیک با حساسیت بسیار بالاتر مورد استفاده قرار می گیرد.

امروزه ELISA یکی از قدرتمند ترین روش های آزمایشگاهی برای پی بردن به اختلالات سیستم ایمنی است، این تست به منظور پی بردن به آنتیژن ناشی از ارگانی عفونی در بدن یا مواد غیر نرمالی که معرف برخی بیماریها است انجام می شود. همچنین آنتی بادیهایی که در پاسخ به برخی عفونتها یا بیماریها بهوجود آمده نیز توسط این تست قابل تشخیص هستند. تست ELISA اولین آزمایش متداول در غربالزنی HIV است. در تست ELISA سرم فرد 400 بار رقیق شده و به صفحه ای که حاوی آنتیژن HIV است اضافه میشود. اگر آنتی بادی HIV در سرم وجود داشته باشد، به این آنتیژن های HIV می چسبد. سپس به منظور از بین بردن دیگر اجزا سرم، پلیت شستشو داده می شود. یک "آنتی بادی ثانویه" ساخته شده مخصوص (یک آنتی بادی چسبیده به آنتی بادی دیگری) به پلیت اعمال شده و شستشوی دیگری انجام میشود. این آنتی بادی ثانویه به صورت شیمیایی به آنزیم از پیش تهیه شده میچسبد. اینبار زیر لایه ای برای آنزیم اعمال شده و توسط آنزیم کاتالیز میشود که منجر به تغییر رنگ در فلورسانس می شود.

نتایج ELISA به صورت عددی گزارش میشود. بحثانگیزترین وجه این تست تعیین نقطه برش بین نتایج مثبت و منفی است.

علاوه بر آزمایش HIV از ELISA برای آزمایش بیماریهایی چون هپاتیت، تب استخوانشکن، leptospirosis ، عفونت انگلی، تبخال، سرخجه و دیگر عفونتهای ویروسی و باکتریایی استفاده میشود.

پیش از پیدایش روش ELISA ، تنها گزینه برای انجام سنجش ایمنی، ایمنی سنجی رادیویی بود، که از آنتی ژن ها و آنتی بادی هایی که به صورت رادیواکتیو ممیز شده بودند استفاده میشد. در این روش در صورت وجود آنتی بادی یا آنتیژنی خاص، رادیواکتیویته سیگنالی تولید میکرد. تئوری روش ایمنی سنجی رادیویی اولین بار سال 1960 توسط Rosalyn Sussman Yalow و Solomon Berson مطرح شد. از آنجاییکه رادیواکتیویته خطرات زیستی داشت، پیشنهاد امن تر و ایمن تری مبنی بر جایگزینی سیگنال های غیر رادیو اکتیو به جای سیگنال های رادیو اکتیو ارائه شد. وقتی یک آنزیم مشخص (مانند پر اکسیداز) با زیر لایه مناسب واکنش می دهد، منجر به تغییر رنگ آن میشود که می تواند به عنوان سیگنال استفاده شود. البته باید تناسب بین سیگنال و وجود آنتیبادی یا آنتی ژن تعیین میشد که این پروسه توسط Stratis Avrameas و G.B. Pierce انجام شد. در سال 1966 توسط Wide و Porath این روش تکمیل تر شد. و در سال 1971 Peter Perlmann و Eva Engvall نهایتا به روش ELISA به شیوه امروزی دست پیدا کردند. ELISA امروزی مزایای زیادی نسبت به روشهای ایمنی سنجی رادیویی دارند. از جمله عدم وجود خطر تشعشع، امکان اتوماسیون، امکان افزایش حساسیت روش، عمر طولانی کیت های آنزیمی، سرعت خوانش بالا و قیمت ارزانتر دستگاهها و معرف ها.

 

maxin

Well-known member

• 2014-03-20

• #2

تست elisa با روشهای گوناگونی انجام میشود که که به صورت کلی به دو دسته elisa مستقیم و غیر مستقیم تقسیم بندی میشود. در روش مستقیم آنتی ژن یا آنتیبادی مورد نظر به طور مستقیم بر سطح فاز جامد پوشش داده می شود و سپس آنتیبادی یا آنتی ژن مکمل نشاندار شده آن به سیستم اضافه میشود. با آنالیز سیگنال تولید شده میتوان پی به وجود آنتی ژن یا آنتی بادی مورد نظر در نمونه برد. این روش ارزش تشخیصی چندانی نداشته و بیشتر کاربرد تحقیقاتی دارد.

در روش غیر مستقیم سرم رقیق شده به آنتی ژن های پوشش داده شده در فاز جامد اضافه می شود، سپس نمونه را به آن اضافه کرده و پس از گذشت زمان انکوباسیون و یک مرحله شستشو، آنتی هیومن گلوبولین نشاندار شده با آنزیم به چاهک اضافه می شود. این روش برای تعیین آنتی بادی اختصاصی یا تیتراسیون آنتی بادی در سرم استفاده میشود.

روش های elisa ساندویچ و elisa رقابتی یا مهاری از دیگر انواع متداول این تکنیک هستند. روش ساندویچ که متداولترین روش elisa است، یک آنتی ژن در بین دو آنتی بادی اختصاصی قرار می گیرد. روش های رقابتی نیز بر پایه رقابت دو آنتی ژن یا دو آنتی بادی برای اتصال لیگاند با مقدار محدود استوار است. اگر اضافه کردن هردو آنالیت به سیستم همزمان انجام شود، روش را رقابتی می نامند ولی چنانچه ابتدا آنالیت اضافه شده و پس از یک دوره زمانی انکوباسیون آنالیت نشاندار اضافه گردد روش را مهاری می نامند.

مراحل انجام یک آزمون elisa که تقریبا در تمام انواع آن مشترک است عبارت است از:
1) پوشش دهی، که به معنی جذب یک آنتیژن یا آنتیبادی با سطوح جامد است.

2) اضافه کردن نمونههای مورد آزمایش.

3) گذشت مدت زمان کافی برای انجام واکنش که به اصطلاح انکوباسیون واکنشگرها نامیده می شود.

4) انجام عمل شستشو توسط واشر elisa ، به منظورجدا کردن واکنشگرهای متصل شده و واکنش داده از واکنشگرهای آزاد و متصل نشده .

5) اضافه عوامل لینک شده با آنزیم.

6) مجددا طی مدت زمان انکوباسیون برای واکنشگرها .

7)استفاده مجدد از واشر elisa جهت انجام عمل شستشو .

8) افزودن زیرلایه آنزیم جهت تشخیص واکنش دهندهها.

9) طی زمان انکوباسیون.

10) اتمام واکنش آنزیمی توسط متوقف کنندهها و خوانش دانسیته نوری به دست آمده توسط خواننده .elisa

برای انجام تست ELISA باید نمونه خون از بیمار گرفته شود و سرم آن جدا شود. برای این کار باید به مواردی دقت داشت. مثلا از بستن گارو برای مدتی طولانی باید اجتناب کرد چرا که ممکن است در پارامترهای مورد اندازه گیری تاثیر گذاشته و موجب بروز خطا شود. در هنگام جداسازی سرم نیز باید دقت شود که فیبرینوژن یا ذرات دیگر نباشد. پیش از انجام آزمایش باید به کیفیت کیت های مورد مصرف توجه کرد، همچنین نگهداری آنها باید در دمایC 8-2 صورت گیرد. تمامی محلولهای موجود در کیت قبل از مصرف بایدخوب مخلوط شده و به دمای آزمایشگاه برسد و پس از استفاده به منظور افزایش پایداری، بلافاصله اجزاء کیت به یخچال منتقل شود. درحین انجام آزمایش باید از نوسانات غیر تدریجی دما در هنگام انکوباسیون، مانند باز بودن پنجره یا درب آزمایشگاه در محل آزمایش جلوگیری کرد. ایجاد پدیده هوک باعث ایجاد نتایج پایین کاذب میشود لذا توصیه میشود برای جلوگیری از این پدیده سرم رقیق نشده و سرم یک دهم رقیق شده، مخلوط وآزمایش را انجام دهیم، تا اثر احتمالی هوک اصلاح شود. از آنجا که فریز و دیفریز کردن نمونه ها باعث کاهش سطح برخی از هورمون ها میشود، باید تا حد ممکن از این کار پرهیز شود. پیش از اندازه گیری باید کلیه ابزارهای مورد استفاده اعم از نوک ابزار نمونهگیری و کیت ها استریل شوند. که البته استفاده از ابزارهای یکبار مصرف پیشنهاد میشود و باید قبل از استفاده لوله آزمایش های شیشهای آنها را با اسید سولفوریک رقیق شستشو داده و با آب مقطری که دوبار تقطیر شده آبکشی انجام داد. از به کار بردن محلولهای شستشوی نامناسب یا آب مقطر ناخالص باید پرهیز کرد. ضمنا باید از کارکرد صحیح دستگاهها و تجهیزات مورد استفاده به عنوان مثال از صحت طول موج فیلترهای خواننده ELISA به کمک استفاده از ماده رنگی با ثبات، نظیر بیکرومات پتاسیم یا عملکردصحیح دستگاه واشر ELISA اطمینان حاصل کرد.

 

maxin

Well-known member

• 2014-03-20

• #3

شیکر ELISA SHAKER) ELISA)

تکان دادن میکروپلیت ها )shaking( از مهمترین بخش های تکنیک ELISA است، چرا که تاثیر زیادی در تغییر رنگ محیط آنزیمی پس از افزودن محلول اسیدی دارد. استفاده از روتاتور معمولی با قطر چرخش زیاد و تعداد دور کم و در نتیجه تکان دادن آهسته میکروپلیتها باعث خوب مخلوط نشدن معرفها و در نتیجه ادامه و پیشرفت جزئی واکنش در طی زمان و به روز خطا میشود. همچنین تکان شدید این پلیت ها نیز باعث آلوده شدن چاهک های میکرو پلیت با هم میشود. شیکر ELISA دستگاهی است که برای مخلوط کردن محتویات میکروپلیتها به کار گرفته می شود. شیکر ELISA با حرکت سریع با قطر چرخش کم باعث اختلاط مناسب معرفها و در نتیجه پیشرفت واکنش در طی زمان میشود. شیکرهای امروزی مجهز به سیستم کنترل زمان و کنترل دور به صورت دیجیتال است.

واشر ELISA washer)ELISA)

از دیگر مراحل مهم تست ELISA ، شستشو است که در هر مرحله از تست به منظور دفع و تخلیه کامل مولکولهای غیر اختصاصی از محیط واکنش انجام می گیرد. شستشو به دو صورت دستی و خودکار انجام می شود. ابتدایی ترین روش شستشو، شستشوی دستی است بدین ترتیب که مایع شستشو را با پیپت بر روی چاهک ها ریخته و سپس آن را در سینک خالی می کنند. فشار بالای شستشو در روش دستی که به علت تخلیه سریع بافر به وجود میآید، منجر به جداشدن و حذف اتصالات اختصاصی از کف چاهکها و کاهش کاذب میشود، همچنین فشار پائینشستشو ناشی از تخلیه آهسته بافر، باعث عدم دفع کامل اتصالات غیر اختصاصی و افزایش کاذب جذب نوری میشود. بهتر است در روش دستی تا نزدیک لبه فوقانی چاهک ها از محلول شستشو پر شود، در صورت پر شدن لب به لب چاهکها، احتمال آلودگی چاهک به چاهک افزایش پیدا میکند. همچنین باید از سرریز شدن محلول شستشو، ایجاد حباب هوا در چاهکها و تماس با کف چاهک جلوگیری کرد. در هنگام تخلیه چاهکها نیز باید مکش و تخلیه به طور کامل انجام شده و دقت شود که حتی ذره ای از مایع بافر در کف چاهکها باقی نماند. اما این روش شستشو (شستشوی دستی) بسیار وقت گیر بوده و خطر آلودگی محیط و کاربر را در پی دارد. از این رو دستگاههای خودکار واشر ELISA برای شستشوی پلیت ها به وجود آمده است که علاوه بر دقت و ایمنی بالاتر، سریعتر و راحتتر عمل شستشو را انجام می دهند. این دستگاهها در انواع مختلف 8 یا 12 کاناله، تک سوزنه و دوسوزنه موجود است. در انواع دو سوزنه، یک سوزن برای ریختن و دیگری برای خالی کردن محلول شستشو استفاده میشود بدین ترتیب که یک سوزن به طور دائم در حال مکش است تا اگر مایع شوینده بیشتری در هنگام پر کردن وارد چاهک ها شد ، آنرا خالی کند و این در حالیاست که در مدل تک سوزنه تمامی اقدامات توسط همان یک سوزن صورت می گیرد.

خواننده ELISA reader) ELISA)

خواننده ELISA در واقع یک دستگاه فتومتر است که در آخرین بخش از تست ELISA به طور اختصاصی برای خواندن نمونه های مربوطه طراحی شده است. وظیفه آن طیفسنجی نوری یا خوانش دانسیته نوری واکنش ELISA است. طول موج مشخصی از نور از پائین درون چاهک میگذرد، در مسیر آن فیلتر مناسبی باتوجه به نوع آنزیم و نوع سوبسترای آنزیم جهت دستیابی به طول موج مطلوب قرار داده می شود. در بسیاری از خوانشگرها سیستم تک موج یا دو موج است و جهت برطرف سازی نقص سیستم نوری ، تغییرات چاهک به چاهک حجم نهایی در چاهک ها، تصحیح جذب نوری به طور خودکار صورت می گیرد . این عمل توسط نوع خاصی از فیلترتحت عنوان فیلترهای تفاضلی صورت می گیرد. خوانش میزان جذب محتوی چاهکها توسط خواننده ELISA الزاما بایستی در زمان تعیین شده انجام شود. بعضی از دستگاههای خواننده ELISA قابلیت برنامهریزی زمانی، نوع تشخیص و کنترل و در نهایت مشخص کردن مثبت یا منفی بودن نمونههای مجهول را دارا هستند.
امروزه انواع مختلفی از خوانشگرها برای پلیت ها ی ELISA در بازار موجود هستند اکثر این خوانشگرها یک ستونی یا 96 خانه (یک پلیتی) بوده که اکثرا خودکار و تعداد اندکی نیز دستی هستند. این دستگاهها دارای فیبرهای نوری هستند. در دستگاههای خواننده انتخاب طول موج توسط فیلترها یا گریدها (گریتینک ساختارهایی که با تابیده شدن نور به آنها، تنها نور با طول موج خاصی ازآنها ساطع می شود) انجام می شود. برای چاپ نتایج نمونههای موردآزمایش ، یا دستگاه خود دارای پرینتر است یا می توان آنرا به پرینتری متصل کرد. همچنین می توان جهت انجام محاسبات بیشتر خواننده ELISA را به کامپیوتر وصل کرد

 

maxin

Well-known member

• 2014-03-20

• #4

اواع روش هاس الایزا

1- روش رقابتی: دو Ab برای اتصال به یک Ag واحد رقابت دارند و OD نسبت عکس با ماده مورد نظر دارد.
​

2- روش غیررقابتی:
1) روش ساندویچی (2 مرحله ای) : روش بسیار حساسی است.
2) روش یک مرحله ای : Ab روی فاز جامد + Ag سرم بیمار + Ab نشاندار کمپلکسAb-Ag-Ab بعد از شستشو با کروموژن واکنش رنگی میدهد.

Solid phase(plate) :
1- پلی وینیل کلراید نمی شکند، خم می شود. سطح آن صاف و گرد است.
2- پلی استرن نمی شکند، خم نمی شود. سطح آن صاف است.
حجم سطح صاف=300میکرو لیتر و حجم سطح گرد= 200 میکرو لیتر
خطای Carry Over :
در الیزا حجم مورد نیازی که به داخل ول ها ریخته می شود یا تخلیه می شود باید حداکثر 200 λ باشد تا امکان ریزش به ول کناری وجود نداشته باشد. ومینیسک باید یکنواخت باشد.

پدیدهStacking یاLagering :
در عمل Coating پلیتهای الیزا اگر از پروتئینهایی با غلظت بالا یا ناخالص استفاده شود ممکن است پروتئینهاروی هم سوار شده و میزان Ab کمتری امکان اتصال پیدا کند و در نتیجه جواب منفی کاذب گرفته شود. حتی اگر Ag کد شود باید کلاف پروتئینهای Ag باز باشد تااپی توپ های Ag برای اتصال بیرون و مشخص باشند.
پدیده Coating برگشت پذیر می باشد.

پدیده Leaching :
در درست استفاده نکردن از میکروپلیتدر عمل شستشو و عمل Taping بوجود می آید و باعث کاهش OD خوانده شده می شود. نور، گرما، سرما، تاریکی، رطوبت همگی در یک کیت الیزا برای plate آن تثبیت شده است و تغییر ناگهانی هر یک از این عوامل از ویژگی plate می کاهد مثلاً استفاده چندین بار از یک کیت که مرتباًآنرا داخل یخچال بگذاریم و برداریم و اگر میکروپلیت کاملاً استفاده نشود باید حتما در پاکت آلومینیومی قرار داده شود و عاری از نور و منفذ باشد. در مورد شستشو تعداددفعات آن فرقی ندارد ولی PH محلولBuffer Wash بسیار مهم است و باید دقت شود. همچنین عمل Taping باید استاندارد باشد.

پدیده اثر حاشیه ای یا edge effect : (ول هایی که در حاشیه هستندOD کمتری نسبت به ول های مرکزی دارند)
هر ولی از یک طرف یا دو طرف آن بسته است و میزان گرمایی که به آنها می رسد، متفاوت است.
راه حل: دما و شرایط انکوباسیون استاندارد باشد. از انکوباتور مخصوص میکروپلیت استفاده شود نه انکوباتور سرولوژی، معمولاً انکوباسیون با حرکت ,اثر حاشیه ای را کم می کند Orbital moution shaker که حرکت آن در همه جهات )مثل 8انگلیسی) است. برای دمای اتاق º18-25باید جای ثابتی با شد بدون جریان هوا و تغییرات دما کاملاً کنترل شود.
edge effect در عمل پدیده Coating هم اثر دارد مثلاً ممکن است wellهای حاشیه ای زودتر از well های وسطی کد شوند .

پدیدهStacking :
اگر تعداد plate هایی که در انکوباتور قرار می دهیم زیاد باشد، باید طوری قرار بگیرند که هوا بین آنها جریان داشته باشد.

موادی که در الیزا استفاده می شود:
1) آنزیمHorseradish peroxidase HRP : منشاء گیاهی دارد و ارزان است. از ترب سیاه گرفته می شود و بسیار به روش کالی متری حساس است. سوبسترای آن H2o2 می باشد و کروموژن آن سرطانزا و به نور حساس است.
کروموژن انواع :1- تترا متیل بنزیدین(TMB)
2-ا فنیل دیامین(OPD)

2) آنزیم آلکالن فسفاتاز: از روده گوساله گرفته می شود با بافرتریس انجام می شود (پایدارتر ولی گران تر است) و سوبسترای آن پارانیتروفنیل فسفات است و Stop آن محلول بی کربنات می باشد.
انواع شستشو:
1-شستشو با دستگاه
2-شستشوی دستی:استفاده از سرنگ-پبپت-پیپتور غلط است و باید حتما از سمپلر چند کاناله استفاده شود و نباید wash buffer با فشار ریخته شود و یا ایجاد حباب کندچون حباب مانع اتصال مولکولها میشود.
3) Tap Water : شستشو با شیر اب است.
4) Sooking Time : یعنی بعد از ریختن wash بین 1 تا 5 دقیقه بماند و بعد تخلیه شود . در این صورت میتوان در صورت نیاز تعداد دفعات شستشو را کم کرد.
5) عمل Dipping : یعنی کل Plate داخل کاسه آب قرار گیرد.

انکوباسیون:
1- روش ساکن Stationary incubation باید مراقب Stacking و effect edge باشیم زیرا متغیرهای محیط زیاد است.
2- روش چرخشی Roatating incubation اثرات Stacking و edgo effect کمتر شده و زمان نیز کم می شود و صحیح تر است.
دما:
1. 37[SUP]o[/SUP][SUB]C[/SUB]
2. room Temperature)18-25º)
شرایط دماباید ثابت و بدون جریان هواباشد داخل کشوبا دمای ثابت مناسب است.نور آفتاب به آن نخورد و استفاده از انکوباتور سرولوژی 25[SUP]o[/SUP] نیز مناسب است.
3. 4 [SUP]o[/SUP][SUB]C[/SUB][SUB]زیاد[/SUB] مناسب نیست چون یخچال رطوبت دارد.

تست Micro plate Test:
پلیت خالی داخل دستگاه گذاشته و OD همه خانه ها خوانده شود. اختلاف آنها نباید بیشتر از 01/0± باشد در اینصورت اشکال از دتکتور دستگاه می باشد.

پدیده Shear effect یا قیچی کردن:
اگر سرم در فریزر 4- باشد، چون بتدریج یخ می زند آب سرم نیز یخ می زند و ایجاد کریستال می کند که در زمان ذوب شدن به پروتئینهای Ab آسیب می رساند و آنها را در اصطلاح قیچی می کند، بنابراین بهتراست برای نگهداری مدت طولانی در[SUP]o[/SUP] 20- فریز کنیم.
گذاشتن کاور روی plate در زمان انکوباسیون جلوگیری از تبخیر محتویات ول ها در حین آزمایش می کند. ​